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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Haltung und Wartung von Mäusen
- Kaufen Sie 6-8 Wochen alte NSG-Mäuse (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Halten Sie die Mäuse unter SPF-Bedingungen mit Luftaustausch, Vorfiltern und hocheffizienten Schwebstofffiltern (HEPA) (0,22 μm) in einem Raum mit kontrollierter Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Druck.
- Unterbringung und Pflege der Mäuse in autoklavierten individuellen Mikroisolatorkäfigen in einem Rack-System, das den Luftaustausch mit Vorfiltern und HEPA-Filtern (0,22 μm) steuern kann.
- Führen Sie alle Verfahren und Manipulationen an den Mäusen in einem biologischen Sicherheitsabzug der Klasse II Typ A2 durch, der mit 70 % Ethanol vorbehandelt wurde. Bevor Sie im Tierzimmer arbeiten, duschen Sie und ziehen Sie sich saubere Kittel, einen Tyvek-Anzug, Stiefelüberzieher, eine Haarkappe, eine Gesichtsmaske und Handschuhe an. Tragen Sie bei chirurgischen Eingriffen einen OP-Kittel über dem Tyvek-Anzug.
Anmerkung: Eine Dekontamination mit ultraviolettem (UV) Licht wird ebenfalls vor Eingriffen bevorzugt.
- Autoklavieren Sie nach Möglichkeit alle Instrumente und Reagenzien und desinfizieren Sie sie, bevor Sie sie in den Abzug bringen.
- Nehmen Sie während der Eingriffe die individuell belüfteten Käfige der Tiere aus dem Gestell und desinfizieren Sie sie, bevor Sie sie in den Abzug bringen.
- Füttern Sie die Mäuse mit einer bestrahlten Diät und stellen Sie autoklaviertes Wasser zur Verfügung. Versorge bestrahlte Nahrung und ergänze sie bei Bedarf mit zusätzlicher bestrahlter Nahrung. Wechseln Sie das autoklavierte Wasser wöchentlich oder nach Bedarf.
Anmerkung: Es kann auch autoklaviertes angesäuertes Wasser verwendet werden. Das bereitgestellte bestrahlte Futter hatte eine Haltbarkeit von 6 Monaten nach der Herstellung.
>2. Erzeugung von humanisierten Knochenmark-, Leber- und Thymusmäusen (BLT)
HINWEIS: Die Erzeugung von hu-BLT-Mäusen wurde bereits beschrieben.
- Am Tag der Operation wird den Mäusen eine Ganzkörperbestrahlung in einer Dosis von 12 cGy/g Körpergewicht verabreicht.
- Bereiten Sie die Mäuse auf die Operation vor.
- Geben Sie jeder bestrahlten Maus eine Mischung aus Ketamin in einer Arbeitskonzentration von 100 mg/kg und Xylazin in einer Konzentration von 12 mg/kg, die zwischen 130 und 170 μl pro Maus lag, bezogen auf das Körpergewicht durch intraperitoneale (IP) Injektion zur Anästhesie. Zur Herstellung von 3 ml des Ketamin-Xylazin-Gemisches fügen Sie 0,27 ml Ketamin in einer Stammkonzentration von 100 mg/ml und 0,03 ml Xylazin in einer Konzentration von 100 mg/ml auf 2,7 ml sterile Kochsalzlösung hinzu und mischen Sie es gut. Desinfizieren Sie die Haut vor der Injektion mit 70% Isopropanol.
- Geben Sie jeder bestrahlten Maus Buprenorphin 1 mg/kg Körpergewicht (Halbwertszeit 72 h, SR-LAB) durch subkutane Injektion für eine lang anhaltende Schmerzbehandlung.
- Geben Sie jeder bestrahlten Maus 100 μl (858 μg) Cefazolin durch IP-Injektion zur präoperativen Antibiotikaprophylaxe.
- Rasieren Sie die Haare der Mäuse mit einer elektrischen Haarschneidemaschine um die linke laterale und mediale Seite der Maus an der späteren Operationsstelle, an der die linke Niere freigelegt wird.
- Überprüfen Sie die richtige Anästhesie durch Pedalreflex (festes Einklemmen der Zehen).
- Geben Sie Isoflurangas in einer Menge von 3-5%, wenn zu irgendeinem Zeitpunkt während der Operation eine zusätzliche Anästhesie erforderlich ist.
- Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Bringen Sie bei Bedarf eine Ohrmarke an.
- Führen Sie eine Operation durch, um das Leber- und Thymusgewebe in die linke Nierenkapsel zu implantieren.
- Desinfizieren Sie die Haut an der Operationsstelle, indem Sie ein Jodpeeling auftragen, das von der Mitte der Operationsstelle ausgeht und sich kreisförmig nach außen bewegt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit 70% Isopropanol und ein drittes Mal mit Jod.
- Laden Sie zunächst mit einer Pinzette ein menschliches fetales Lebergewebefragment in einen Trokar. Laden Sie dann mit einer Pinzette ein menschliches Fragment des fötalen Thymusgewebes in den Trokar. Laden Sie dann mit einer Pinzette ein weiteres Fragment des menschlichen fötalen Lebergewebes in den Trokar. Das Gewebe sollte auf 1-1,6 mm3 zugeschnitten werden, um es den Innenmaßen des Trokars anzupassen.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut anzuheben, und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt in Längsrichtung zu machen. Verlängern Sie den Schnitt auf 1,5-2 cm in der linken Seite der Maus.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Muskelschicht anzuheben, und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt in Längsrichtung zu machen. Verlängern Sie den Schnitt nach Bedarf, um die Niere freizulegen.
- Legen Sie die Niere frei, indem Sie das Fettgewebe, das die Niere umgibt, sanft greifen. Berühren Sie das Nierenparenchym nicht direkt.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen 1-2 mm großen Schnitt am hinteren Ende der Nierenkapsel.
- Führen Sie den vorgespannten Trokar langsam durch den Schnitt parallel zur Längsachse der Niere ein und lösen Sie das Gewebe zwischen Nierenkapsel und Niere.
- Bringen Sie die Niere und den Darm vorsichtig wieder in ihre normale Position. Verwenden Sie resorbierbare 5/0 P-3 (P-13) Nähte mit einer 13 mm 3/8 Kreisnadel, um die Muskelschicht zu schließen, und chirurgische Klammern, um die Haut zu schließen.
- Setzen Sie die Maus nach der Operation zur Genesung in einen sauberen autoklavierten Mikroisolatorkäfig.
- Um den Wärmeverlust während der postoperativen Genesung zu minimieren, stellen Sie den Käfig mit den Mäusen auf ein Heizkissen, das mit einer Wasserpumpe verbunden ist, die das Wasser erwärmt und zirkuliert.
- Überwachen Sie die Mäuse, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten.
- Innerhalb von 6 Stunden nach Abschluss der Operation werden über die Schwanzvene hämatopoetische CD34+-Stammzellen injiziert, die aus menschlichem fetalem Lebergewebe isoliert wurden.
- Wärmen Sie die Mäuse mit einer Wärmelampe auf. Desinfizieren Sie den Schwanz mit 70% Isopropanol und injizieren Sie dann 1,5 bis 5 × 105 Stammzellen/200 μl in die Schwanzvene.
- Stoppen Sie alle Blutungen aus der Injektion und bringen Sie die Mäuse in den Mikroisolatorkäfig und den Mikroisolatorkäfig in den Käfig zurück.
Anmerkung: Mäuse nach der Operation werden in der Regel zusammen gehalten, fünf pro Mikroisolatorkäfig, während und nach der Genesung. Mäuse werden jedoch nur dann zusammen untergebracht, wenn sie alle am selben Tag operiert wurden.
- Kontrollieren Sie die Mäuse täglich. Überwachen Sie die chirurgischen Klammern sorgfältig und tauschen Sie sie bei Bedarf aus. Überwachen Sie die Mäuse genau auf Anzeichen von Infektionen oder Beschwerden. Geben Sie autoklavierte Nahrung für einige Tage nach der Operation auf den Boden des Mikroisolatorkäfigs.
- Entfernen Sie die chirurgischen Klammern 7-10 Tage nach der Operation. Geben Sie Isoflurangas in einer Menge von 3-5%, um die Mäuse zu betäuben. Entfernen Sie vorsichtig die Klammern und tragen Sie dann ein Antibiotikum und eine schmerzlindernde Salbe auf die Stelle auf.
- Warten Sie 9-12 Wochen für die Rekonstitution der menschlichen Immunzellen und entnehmen Sie dann peripheres Blut aus der Vena saphena medialis von jeder der humanisierten Mäuse.
- Fesseln Sie Mäuse bei Bewusstsein mit einem Kegel in geeigneter Größe mit einer Öffnung in der Nähe des Mauskopfes zum Atmen und einer Öffnung in der Nähe des Rückens der Maus, um ein Bein zu isolieren. Setzen Sie die Mäuse mit dem Kopf zuerst in den Haltekegel und ziehen Sie dann vorsichtig ein Bein durch die Beinöffnung.
- Sprühen Sie die mediale Seite des isolierten Beins mit 70% Isopropanol ein und verteilen Sie dann ein Antibiotikum und eine schmerzlindernde Salbe auf die gleiche Stelle.
Anmerkung: Die Salbe hilft, die Lage der Vene zu erkennen, ohne dass eine Haarentfernung erforderlich ist, und hilft auch bei der Bildung von Blutstropfen.
Punktieren Sie - die Vene mit einer 25-Gauge-Nadel in einem 90°-Winkel und sammeln Sie 50-100 μl Blut mit einem mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) beschichteten Blutentnahmeröhrchen. Stoppen Sie die Blutung, indem Sie mit steriler Gaze Druck auf die Stelle ausüben. Sobald die Blutung aufgehört hat, bringen Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück.
Anmerkung: Die maximal entnommenen Blutmengen betragen in der Regel 50 μl pro Woche oder 100 μl alle zwei Wochen.
- Verwenden Sie das gesammelte periphere Blut, um den Grad der Rekonstitution menschlicher Immunzellen mittels Durchflusszytometrie mit Antikörpern für hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19 zu testen.
>3. Behandlung mit Antibiotika
- Entnehmen Sie vor der Antibiotikabehandlung Stuhlproben vor der Behandlung. Bringen Sie die Mäuse in einen neuen autoklavierten Mikroisolatorkäfig.
- Bereiten Sie täglich einen frischen Cocktail aus Breitbandantibiotika zu.
- Bereiten Sie 250 ml Wasser vor, das frisch zubereitetes Metronidazol (1 g/l), Neomycin (1 g/l), Vancomycin (0,5 g/l) und Ampicillin (1 g/l) für jeden Mikroisolatorkäfig von Mäusen enthält.
Anmerkung: Verwenden Sie autoklaviertes oder steriles Wasser für das mit Antibiotika angereicherte Trinkwasser.
- 9,2 g Traubenzucker gesüßte Getränkemischung in 250 ml mit Antibiotika versetztes Wasser geben.
Anmerkung: Die Verwendung von mit Traubenzucker gesüßten Getränkemischungen überdeckt den bitteren Geschmack der Antibiotika und hilft, Dehydrierung bei den Mäusen zu verhindern.
- Wechseln Sie das Antibiotikum und das mit Traubenzucker gesüßte Getränk, mischen Sie Wasserzusatz und setzen Sie die Mäuse täglich in einen neuen autoklavierten Käfig.
Anmerkung: Mäuse sind koprophag und der tägliche Wechsel der Käfige verhindert, dass sich die Mäuse erneut mit Darmbakterien impfen.
- Für eine maximale Transplantation des menschenähnlichen Darmmikrobioms stellen Sie 14 Tage lang Antibiotika zur Verfügung. Überwachen Sie die Mäuse während der Antibiotikabehandlung auf Gewichtsverlust und Dehydrierung. In den ersten 3-4 Tagen ist mit einem Gewichtsverlust zu rechnen, der danach für die Dauer der Behandlung ein Plateau erreicht. Wenn eine Dehydration auftritt, geben Sie den Mäusen Kochsalzlösung oder Ringers-Lösung durch intraperitoneale Injektion.
Anmerkung: Andere Protokolle zur Humanisierung des Darmmikrobioms erfordern eine orale Gabe von Antibiotika. Wir stellten fest, dass die weniger invasive Methode der Zugabe von Antibiotika zum Trinkwasser zwar wirksam war, aber unsere humanisierten Mäuse weniger belastete und zu besseren Ergebnissen führte.
>4. Spenderproben und Stuhltransplantation
- Bereiten Sie Stuhlproben von menschlichen Spendern vor.
- Verwenden Sie ordnungsgemäß vorbereitete Quellen für fäkales Mikrobiota-Transplantationsmaterial (FMT) für die Stuhltransplantation in die humanisierten Mäuse.
- FMT-Präparate auftauen und unter anaeroben Bedingungen in einer anaeroben Kammer aliquotieren.
- Falls gewünscht, mischen Sie in diesem Schritt gleiche Teile der Stuhlproben miteinander, um eine unvoreingenommene "menschliche" Probe zu erhalten.
- Beschränken Sie das Einfrieren und Auftauen des FMT-Materials auf ein Minimum, wenn kein Aliquotieren oder Mischen der Proben erforderlich ist, tauen Sie es nur unmittelbar vor dem Eingriff auf.
- Stuhltransplantation beim Menschen
- Wechseln Sie nach Abschluss der 14-tägigen Antibiotikabehandlung das Trinkwasser in autoklaviertes Wasser und bringen Sie die Mäuse in einen neuen autoklavierten Käfig. Stoppen Sie den täglichen Käfigwechsel und führen Sie einen Zeitplan für den Käfigwechsel alle 1-2 Wochen ein.
- Geben Sie 24 und 48 Stunden nach Beendigung der Antibiotikagabe zwei Stuhltransplantationen.
- 24 Stunden nach der Antibiotikabehandlung die benötigte Menge an FMT-Material auftauen und jeder Maus 200 μl FMT-Material über eine orale Sonde geben. Wiederholen Sie den Vorgang 48 h nach der Einnahme von Antibiotika.
- Verteilen Sie restliches oder übrig gebliebenes aufgetautes FMT-Material auf dem Fell der vermenschlichten Mäuse oder auf der Käfigeinstreu.