Erzeugung eines multivalent anzeigenden Impfstoffs gegen äußere Membranvesikel

Abstract

Quelle: Feng, R., et al. Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform, die auf äußeren Membranvesikeln basiert, die eine SARS-CoV-2-Rezeptor-Bindungsdomäne aufweisen. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von multivalent anzeigenden Impfstoffen mit äußerem Membranvesikel (OMV). Säugetierzellen werden transfiziert, um virale Antigene zu exprimieren und zu sezernieren, die mit einem SpyTag und einem Polyhistidin-Tag fusioniert sind. Diese Antigene werden dann mit einer Nickel-Nitriotriessigsäure (Ni-NTA)-Affinitätssäule aufgereinigt. Das gereinigte Antigen wird mit äußeren Membranvesikeln gemischt, die das oberflächengebundene SpyCatcher (SC)-Protein exprimieren. Mehrere Antigene binden sich kovalent über ihre SpyTags (ST) an SpyCatcher und bilden OMVs, die das Antigen anzeigen und als multivalenter Impfstoff dienen.

Protocol

>1. Aufbau von Plasmiden

1. Fügen Sie die DNA, die für die SpyCatcher-Sequenz (Abbildung 1) kodiert, in ein Ampicillin-resistentes pThioHisA-Cytolysin A (ClyA)-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Stellen BamH I und Sal I ein, um das Plasmid pThioHisA ClyA-SC nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren.
2. Ligamieren Sie das synthetisierte SpyTag-SARS-CoV-2-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD)-Polyhistidin-Tag (Histag)-Fusionsgen (Abbildung 1) in ein pcDNA3.1-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den BamH I- und EcoR I-Stellen, um das Plasmid pcDNA3.1 RBD-ST nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren.

>2. OMV-SC Vorbereitung

1. Führen Sie die ClyA-SC-Transformation mit den folgenden Schritten durch.
   1. 5 μl pThioHisA ClyA-SC Plasmidlösung (50 ng/μl) zu 50 μl BL21 kompetentem Stamm geben, vorsichtig blasen und 30 Minuten auf Eis abkühlen lassen.
   2. Die Lösung für 90 s in das Wasserbad bei 42 °C geben und dann sofort die gemischte Lösung für 3 min auf Eis legen.
   3. 500 μl Luria-Bertani (LB)-Medium zur Bakteriensuspension geben und nach dem Mischen bei 220 U/min bei 37 °C 1 h lang kultivieren.
   4. Die gesamte Umwandlung wird auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (100 μg/ml, siehe Materialtabelle) aufgetragen und über Nacht bei 37 °C kultiviert.
      Anmerkung: In nachfolgenden Experimenten wurde das Ampicillin in dem Medium in der gleichen Konzentration gehalten. Ist dies nicht der Fall, kann dies zu einem Verlust von Plasmiden in den Bakterien führen.
2. Führen Sie für die OMV-SC-Produktion die folgenden Schritte aus.
   1. Eine einzelne Kolonie von der Platte (Schritt 2.1.4.) auf 20 ml LB-Medium (Ampicillin-resistent) isolieren und über Nacht bei 220 U/min bei 37 °C kultivieren.
   2. Die bakterielle Lösung (aus Schritt 2.2.1.) wird in ein 2-l-Medium geimpft, bei 220 U/min und 37 ΰC für 5 h bis zum logarithmischen Wachstumsstadium kultiviert (der OD₆₀₀nm liegt zwischen 0,6 und 0,8).
   3. Wenn der OD bei 600 nm der Bakterienlösung 0,6-0,8 erreicht, fügen Sie Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG, siehe Materialtabelle) hinzu, um die Endkonzentration der bakteriellen Lösung auf 0,5 mM zu erhöhen, und kultivieren Sie sie dann über Nacht bei 220 U/min bei 25 °C.
3. Führen Sie die OMV-SC-Reinigung durch.
   1. Die Bakterienlösung bei 7.000 x g bei 4 °C 30 min zentrifugieren.
   2. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,22 μm Membranfilter und konzentrieren Sie ihn dann mit einer 100 kD-Ultrafiltrationsmembran oder einer Hohlfasersäule (siehe Materialtabelle).
   3. Das Konzentrat wird durch einen 0,22 μm Membranfilter filtriert, anschließend mit einer Ultrazentrifuge 2 h lang bei 150.000 x g bei 4 °C zentrifugiert (siehe Materialtabelle) und der Überstand mit einer Pipette entsorgt.
   4. Den Niederschlag mit PBS resuspendieren und bei -80 °C lagern. Die Lösung kann bei -80 °C langzeitstabil bleiben.

>3. RBD-ST Vorbereitung

1. Führen Sie die RBD-ST-Transfektion mit den folgenden Schritten durch.
   1. Wählen Sie ein geeignetes eukaryotisches Expressionssystem (z. B. HEK293F) und kultivieren Sie die Zellen nach der Genesung über Nacht bei 130 U/min bei 37 °C.
   2. Geben Sie 20 μl HEK293F Zelllösung in den automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle), notieren Sie die Anzahl der Zellen, stellen Sie die Konzentration auf 1 x 106 Zellen/ml ein und kultivieren Sie die Zellen dann bei 130 U/min bei 37 °C für 4 h.
   3. Filtrieren Sie das RBD-ST-Plasmid durch einen 0,22-μm-Membranfilter und geben Sie 300 μg Plasmide in das Zellkulturmedium (siehe Materialtabelle), bis das endgültige Volumen 10 ml beträgt; 10 s schütteln.
   4. Polyethylenimin (PEI, 1 mg/ml, siehe Materialtabelle) im Wasserbad auf 65 °C erhitzen, 0,7 mL PEI mit 9,3 mL Zellkulturmedium mischen und intermittierend 10 s.
      Anmerkung: Schütteln Sie die Lösung nicht kräftig. Andernfalls können die entstehenden Blasen die Transfektionseffizienz beeinträchtigen.
   5. Geben Sie Plasmidlösung in die PEI-Lösung, schütteln Sie die Mischung 10 s lang intermittierend und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 °C.
   6. Die Mischung in 280 ml Zellkulturmedium geben und 5 Tage lang bei 130 U/min bei 37 °C kultivieren.
2. Führen Sie die RBD-ST-Aufreinigung durch.
   1. Die Zellen werden bei 6.000 x g bei 25 °C für 20 min zentrifugiert und mit einer Pipette der Überstand aufgefangen.
   2. Füllen Sie die Säule mit 2 mL Ni-NTA-Agarose (siehe Materialtabelle) und waschen Sie sie 3x mit 3x PBS.
   3. Geben Sie Imidazol (siehe Materialtabelle) in den Zellüberstand, um die Endkonzentration von 20 mM zu erreichen, und laden Sie den Zellüberstand 2x.
   4. Fügen Sie 3 Säulenvolumina (CV) PBS hinzu, die 20 mM Imidazol zum Waschen enthalten, und sammeln Sie die Waschfraktion.
   5. Gradienteneluierung mit 3 CV von PBS, die niedrige bis hohe Konzentrationen (z. B. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) von Imidazol enthält; eluiert 2x für jede Konzentration.
   6. Verwenden Sie SDS-PAGE, um den RBD-ST in verschiedenen Konzentrationsgradienten zu identifizieren.

>4. OMV-RBD-Biokonjugation und -Reinigung

1. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der Bicinchoninsäure-Assay-Methode (BCA) (siehe Materialtabelle).
   1. Verdünnen Sie die Standard-Rinderserumalbumin (BSA)-Proteinlösung seriell von 2 mg/ml auf 0,0625 mg/ml, verdünnen Sie die gereinigte OMV-SC und RBD-ST 10x und mischen Sie dann die BCA-Arbeitslösungen A und B (im Assay-Kit enthalten) in einem Verhältnis von 50:1 (v/v).
   2. Verdünnte Proteinlösung (25 μl/Well) zugeben und mit BCA-Arbeitslösung (200 μl/Well) mischen; 30 min bei 37 °C inkubieren.
   3. Messen Sie die Absorption (OD) bei 562 nm jeder Vertiefung und berechnen Sie die Proteinkonzentration aus der Standardkurve.
2. Führen Sie die Biokonjugation von OMV-SC und RBD-ST mit den folgenden Schritten durch.
   1. Mischen Sie OMV-SC und RBD-ST in PBS im Verhältnis 40:1 (w/w).
   2. Vertikal drehen, um die Mischung über Nacht bei 15 U/min bei 4 °C zu mixen.
      Anmerkung: Verschiedene Antigene können unterschiedlich stark reagieren. Man könnte verschiedene Reaktionsverhältnisse ausprobieren, die auf den Eigenschaften des Antigens basieren.

Results

Abbildung 1: Plasmidsequenzen, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin-Natrium	Sangon Biotech	A610028
Automatisierter Zellzähler	Zählstern	Biotech
BCA-Protein-Quantifizierungskit	cwbio	CW0014S
Elektrophorese-Gerät	Kavoy	Power BV
Hochgeschwindigkeits-Gefrierzentrifuge	Bioridge	H2500R
His-Tag Maus mAb	Technologie der Zellsignalisierung	2366 Sek.
Imidazol	Sangon Biotech	A600277
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid	Sangon Biotech	A600118
Ni-NTA His-Bind-Superflow	Qiagen	Artikel-Nr.: 70691
OPM-293 Zellkulturmedium	Opm Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST Plasmid	Wuhan genecreat biologische Techenologie
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	ZSGB-bio	ZLI-9061
Polyethylenimin linear	Polywissenschaften	Artikel-Nr.: 23966-1
Vorgefärbte Proteinleiter	Thermo	Artikel-Nr.: 26616
pThioHisA ClyA-SC Plasmid	Wuhan genecreat biologische Techenologie
Quixstand Benchtop-Systeme (100 kD Hohlfasersäule)	GE Gesundheitswesen
SDS-PAGE Ladepuffer (5x)	Beyotime	Nr. P0015
Natriumchlorid	Sangon Biotech	A100241
Aufhängungsinstrument	Lebenstechnik	Hula-Mixer
Trypton	Oxoid	LP0042B
Ultrazentrifuge	Beckman-Schar	XPN-100
Ultraviolett-Spektralphotometer	Hitachi	U 3900
Hefeextrakt	Sangon Biotech	A610961