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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
Verwenden Sie Balb/cYJ (H2d) Spendermäuse und C57Bl/6 (H2b) Empfängermäuse, um allogene Reaktionen zu untersuchen. Mäuse werden für Versuche im Alter von 8 bis 12 Wochen eingesetzt. Verwenden Sie entweder weibliche oder männliche Mäuse. Syngene Kontrollen bestehen aus Aortensegmenten von C57Bl/6-Spendern zu C57Bl/6-Empfängern.
>1. Vorbereitung von Spendern und Empfängern
HINWEIS: Sowohl der Spender als auch der Empfänger werden vor der Operation betäubt und vorbereitet, um die Ischämie des Transplantats zu minimieren. Injizierbare Anästhetika werden im Protokoll verwendet, um eine Verstopfung des Tieres durch Geräte zu verhindern, die für die Verabreichung von Inhalationsanästhetika erforderlich sind. Falls gewünscht, ist jedoch ein Inhalationsanästhetikum eine geeignete Alternative. Ab der ersten Injektion der Anästhetika dauert der gesamte Eingriff ca. 90 Minuten. Die ischämische Zeit des Transplantats beträgt weniger als 30 Minuten.
- Betäuben Sie die Maus mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin (100 mg/kg; 10 mg/ml) und Xylazin (10 mg/kg; 1 mg/ml). Die Maus wird innerhalb von 10 bis 15 Minuten sediert. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den fettigen Teil des Tierfußballens einklemmen. Verabreichen Sie bei Bedarf 1/3 der ursprünglichen Dosis des Anästhesiecocktails, bis das Tier keinen Entzugsreflex mehr zeigt. Überwachen Sie die Atemfrequenz nach der Verabreichung jedes Cocktails genau. Während der Operation beurteilen Sie den Grad der Anästhesie alle 15 Minuten, indem Sie die vordere Bauchdecke mit einer Pinzette einklemmen. Die Mäuse sollten 60 bis 90 Minuten tief betäubt bleiben.
- Schmieren Sie die Augen der Maus mit einer Augensalbe ein, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Rasieren Sie die Haare so nah wie möglich an der Haut im Bauchbereich vom mittleren Thorax bis zum Schambein. Achten Sie besonders darauf, dass Sie sich keine Haut einschneiden. Verwenden Sie keine Enthaarungscreme, da diese in die Haut aufgenommen werden und entzündlich sein kann.
- Legen Sie die Rückenlage des Tieres auf ein Handtuch über dem Heiztisch oder -polster.
- Reinigen Sie die Operationsstelle mit einem vorläufigen Peeling mit 2% Chlorhexidin. Bereiten Sie einen großen Arbeitsbereich vor, um das Operationsfeld zu maximieren. Beginnen Sie mit dem Schrubben in der Mitte der Operationsstelle und bewegen Sie sich linear oder kreisförmig nach außen. Entsorgen Sie die Gaze. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens 5 weitere Male. Tragen Sie ein Alkohol-Vorbereitungspad auf die gleiche Stelle auf. Sobald der Alkohol getrocknet ist, bereiten Sie die saubere Stelle mit Betadine-Lösung vor und bedecken Sie sie mit steriler Gaze.
>2. End-to-End-Anastomosen-Verfahren
- Operation des Spenders
- Behalten Sie während des gesamten Betriebs eine aseptische Technik bei. Reinigen Sie vor Gebrauch alle Oberflächen der Arbeitsplatte und des Operationstisches mit 0,5 % beschleunigter Wasserstoffperoxidlösung. Wickeln Sie alle chirurgischen Instrumente, Gazes, Vorhänge und Kittel vor dem Gebrauch ein und autoklavieren Sie sie. Überprüfen Sie die Sterilität der Instrumente mit einem Dampfsterilisator-Indikatorstreifen, der in jeder Packung enthalten ist. Zwischen den Operationen werden sterile OP-Handschuhe verwendet und entsorgt. Bei mehreren Operationen sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente zwischen den Anwendungen mit dem Heißglasperlen-Sterilisator.
- Legen Sie die Spendermaus in Rückenlage auf eine saubere, dünne Plexiglasplatte, die mit einem sterilen Tuch umwickelt ist, unter das Operationsmikroskop bei 8-30-facher Vergrößerung.
- Nachdem Sie eine angemessene chirurgische Anästhesie, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben, sichergestellt haben, fahren Sie mit der Operation fort.
- Machen Sie mit einer sterilen Schere einen einzigen Mittellinienschnitt in der unteren Bauchlängsrichtung vom Schambein bis zum Xyphoidfortsatz.
- Öffnen Sie die Bauchwände, um die Kavität mit einem kleinen Retraktor freizulegen.
- Ziehen Sie den Darm mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze vorsichtig nach links vom Tier zurück und bedecken Sie ihn mit Gaze, die mit Kochsalzlösung angefeuchtet ist. Bewegen Sie die Fortpflanzungsorgane nach unten und lokalisieren Sie die infrarenale Aorta und die untere Hohlvene (IVC). Befeuchten Sie das freiliegende Gewebe regelmäßig mit Kochsalzlösung.
- Trennen Sie mit der medizinischen Pinzette Nr. 5 die Aorta von der IVC, von der Höhe der linken Nierenarterie bis zur Bifurkation. Verwenden Sie 10-0 monofile Polyamid-Nähte, um die kleinen Äste in der Nähe der Aorta zu ligieren.
- Sobald die Aorta des Spenders von der IVC getrennt wurde, sättigen Sie das Gefäß mit Kochsalzlösung, decken Sie die freiliegende Kavität mit angefeuchteter Gaze ab und legen Sie den Spender an einem sterilen Ort beiseite. Überprüfen Sie alle 15 Minuten den Status des Spenders (Atem- und Herz-Kreislauf-Funktion und Narkosetiefe). Beginnen Sie mit der Operation am Empfänger und isolieren Sie die Aorta wie unten beschrieben (Schritte 2.2.1 bis 2.2.7).
- Nachdem die Aorta des Empfängers von der IVC getrennt und beiseite gelegt wurde, bringen Sie den Spender unter das Mikroskop. Kreuzklemmung (proximal und distal des interessierenden Segments) der Spenderaorta im Abstand von ca. 5 mm mit zwei 4 mm mikrovaskulären Klemmen.
- Mit der Vannas-Tübingen-Mikroschere wird ein kleines Transplantatsegment (3 bis 4 mm lang) der Bauchschlagader durchtrennt.
Spülen Sie - die exzidierte Aorta mit einer 25 G 5/8-Nadel, die an einer Spritze befestigt ist, mit heparinisierter Kochsalzlösung (100 U/ml). Stellen Sie sicher, dass die Nadelspitze nicht mit dem Gefäß in Berührung kommt.
- Legen Sie die Aorta in heparinisierte (100 U/ml) Kochsalzlösung auf Eis und stellen Sie sie beiseite. Lösen Sie noch unter tiefer Narkose die mikrovaskulären Klemmen. Euthanasieren Sie den Spender durch Exsanguination.
- Implantieren Sie das Spendergefäß innerhalb von 30 Minuten nach der Exzision. Obwohl es möglich ist, ein Spendergefäß für mehrere Empfänger zu verwenden, indem eine größere Länge der Aorta herausgeschnitten wird, sollte die ischämische Zeit auf weniger als 30 Minuten begrenzt werden.
- Vorgang des Empfängers
- Behalten Sie während der gesamten Operation eine aseptische Technik bei, wie bei der Spenderoperation.
- Legen Sie die Empfängermaus in Rückenlage auf eine dünne Plexiglasplatte, die mit einem sterilen Tuch umwickelt ist, unter das Operationsmikroskop bei 8-30-facher Vergrößerung.
- Nachdem Sie eine angemessene Anästhesie sichergestellt haben, fahren Sie mit der Operation fort, wenn das Tier keinen Entzugsreflex zeigt.
- Machen Sie mit einer sterilen Schere einen einzigen Mittellinienschnitt in der unteren Bauchlängsrichtung vom Schambein bis zum Xyphoidfortsatz.
- Öffnen Sie die Bauchwände, um die Kavität mit einem kleinen Retraktor freizulegen.
- Ziehen Sie den Darm mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze vorsichtig nach links vom Tier zurück und bedecken Sie ihn mit Gaze, die mit Kochsalzlösung angefeuchtet ist. Bewegen Sie die Fortpflanzungsorgane nach unten und lokalisieren Sie die infrarenale Aorta und die IVC. Befeuchten Sie das freiliegende Gewebe regelmäßig mit Kochsalzlösung.
- Trennen Sie die Aorta von der IVC, von der Höhe der linken Nierenarterie bis zur Bifurkation. Verwenden Sie bei Bedarf 10-0 monofile Polyamid-Nähte, um die kleinen Äste in der Nähe der Aorta zu ligieren.
- Kreuzklemmung (proximal und distal des interessierenden Segments) der Aorta, ca. 5 mm voneinander entfernt, mit zwei 4 mm mikrovaskulären Klemmen.
- Führen Sie mit der Vannas-Tübingen-Mikroschere eine einzelne horizontale Aortotomie durch und resezieren Sie ein kleines Segment (nicht mehr als 0,5 mm) der Bauchaorta, um das Spender-Aortentransplantat aufzunehmen.
- Spülen Sie die exzidierte Aorta mit heparinisierter (100 U/ml) Kochsalzlösung. Das Spender-Aortentransplantat sollte eine angemessene Länge haben, um die durchtrennten Aortenenden des Empfängers zu verbinden.
- Platzieren Sie das Spender-Aortentransplantat in der orthotopen Position und anastomosieren Sie das Transplantatende des Spenders an das Ende des Empfängers, wobei die jeweilige anatomische Ausrichtung des Transplantats mit der des Empfängers übereinstimmt.
- Fassen Sie vorsichtig die Tunica externa des Gefäßes und drehen Sie sie mit der medizinischen Pinzette Nr. 5 leicht um. Führen Sie die Nadel, die an der monofilen Naht 10-0 Polyamid befestigt ist, mit der Pinzette durch die gesamte Dicke der Gefäßwand, um das Spender-Aortentransplantat an dem resezierten Gefäß des Empfängers zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Behälteröffnung nicht durch versehentliches Vernähen der Rückwand des Behälters verschlossen ist.
- Für durchgehende Stiche legen Sie die Stay-Nähte bei 9 Uhr sowohl in das obere als auch in das untere Ende des Transplantats. Beginnend am oberen Ende des Transplantats ab 3 Uhr anastomosieren Sie die resezierten Enden mit 2 Laufnähten und befestigen die Naht an der Bleinaht.
- Drehen Sie das Transplantat um und setzen Sie die laufende Naht bis zum dorsalen Teil des Gefäßes fort, wobei Sie auf die ursprüngliche Bleinaht treffen. Sichern, ohne viel Druck auf das Gefäß auszuüben. Wiederholen Sie die Naht für die untere Anastomose.
Hinweis: Die unterbrochenen Nähte beginnen auf die gleiche Weise wie die durchgehenden Nähte, mit dem Unterschied, dass das Gefäß mit drei separaten Nähten zwischen den Haltenähten anastomosiert wird. Die Anastomosenzeit beträgt in der Regel 20 Minuten.
- Sobald die Anastomose abgeschlossen ist, lösen Sie die distale mikrovaskuläre Klemme, um retrogrades Blut fließen zu lassen und auf Undichtigkeit an den anastomosierten Stellen zu prüfen. Wenn es ein Leck gibt, legen Sie sofort einen Stich an, um die defekte Stelle zu schließen. Wenn an den Stellen keine Blutungen auftreten, lösen Sie die proximale Klemme.
- Untersuchen Sie das Transplantat und stellen Sie sicher, dass das Transplantat und die proximalen und distalen Teile des Gefäßes des Empfängers keine Blutobstruktion aufweisen. Ein kräftiges Pulsmuster in den Gefäßen des Spenders und des Empfängers zeigt an, dass das Blut frei fließt. Fassen Sie mit der Pinzette vorsichtig ein Ende der Verschlussnähte und drehen Sie das Gefäß leicht um, um die Rückwand des Gefäßes zu inspizieren.
Anmerkung: An beiden Enden der anastomosierten Stellen sollte sich die Gefäßwand nicht kräuseln. Eine schlechte Durchblutung nach dem Entfernen der Klemmen ist ein Zeichen für eine Thrombose.
- Bringen Sie den Darm mit Applikatoren mit Wattespitze wieder in die Bauchhöhle zurück.
- Mit dem Castroviejo-Nadelhalter und der Graefe-Pinzette verschließen Sie die Bauchdecke mit 5-0-Polypropylen-Nähten mit durchgehenden Nähten. Verschließen Sie die Hautschicht mit den gleichen Nähten mit dem subkutikulären Verschluss.
- Verabreichen Sie Torbugesic (1 mg/kg) i.m. unmittelbar nach Abschluss der Transplantation.
- Geben Sie sofort in der Reihenfolge Atipamezol (1 mg / kg), Ketoprofen (5 mg / kg) und erwärmte Laktated Ringer-Lösung subkutan.
- Unmittelbar nach der Operation setzen Sie die Mäuse über Nacht (12 Stunden) in einen beheizten Käfig unter einer Wasserdecke. Setzen Sie die Tiere während der Narkose-Erholungsphase allein an einem sauberen, trockenen und ungehinderten Ort unter. Legen Sie den Käfig (autoklaviert) mit sauberen Papiertüchern aus und stellen Sie die Temperatur der Wasserdecke auf ca. 20 bis 22 °C ein. Stellen Sie trockene und nasse Kroketten ad libitum auf den Käfigboden.
Anmerkung: Ein wesentlicher Bestandteil der postoperativen Versorgung ist die Beobachtung des Tieres und der entsprechende Eingriff, falls erforderlich, während der Genesung von der Narkose und der Operation. Die erforderliche Überwachungsintensität variiert je nach Tier und kann während der unmittelbaren narkosetischen Erholungsphase höher sein als später in der postoperativen Genesung.
- Überwachen Sie Tiere, die sich einer Narkose unterzogen haben, kontinuierlich, bis sie sich vollständig erholt haben. Das Tier muss in der Lage sein, das Brustbein ohne Hilfe aufrecht zu erhalten, und es muss ruhig und schmerzfrei erscheinen, bevor es unbeaufsichtigt gelassen wird.
- Geben Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg BID) und Ketoprofen (5 mg/kg SID) für drei Tage, beide subkutan.
- Überwachen Sie die Herz-Kreislauf- und Atemfunktion, die Körpertemperatur und postoperative Schmerzen oder Beschwerden während der Genesung von der Anästhesie für mindestens drei Tage. Zusätzliche Sorgfalt kann erforderlich sein, wie z. B. die Verabreichung von Analgetika und anderen Medikamenten sowie parenteralen Flüssigkeiten, um Dehydration und Elektrolytverlust zu minimieren.
- Beurteilen Sie den Erfolg der Transplantation, indem Sie die motorische Funktion der Hintergliedmaßen beobachten. Der vollständige Erfolg der Transplantation beinhaltet einen ungehinderten Blutfluss zu den hinteren Gliedmaßen und dem Schwanz, der sofort nach der Genesung des Tieres erfolgen sollte, und eine vollständige Genesung ohne Lähmung der Hintergliedmaßen am zweiten Tag.