Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Chirurgische Vorbereitung, Anästhesie und Analgesie-Regime
- Legen Sie ein steriles Einwegtuch (45,7 cm x 66 cm) auf die OP-Plattform. Fassen Sie die Maus vorsichtig, injizieren Sie Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneal (i.p) zur Anästhesie und injizieren Sie 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan zur Analgesie.
- Stellen Sie die Narkosetiefe durch Zehenkneifen sicher, rasieren Sie die Haare im gesamten Bauchbereich mit einem Rasiermesser und platzieren Sie die Maus auf der sterilen Operationsplattform unter dem Operationsmikroskop bei 6-10-facher Vergrößerung.
>2. Milzentnahme durch Spender
- Sterilisieren Sie den Bauch mit einem Alkoholpräparationspad, sichern Sie die Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband und machen Sie mit einer Schere einen 3-4 cm langen vertikalen Hautschnitt in der Mittellinie vom Schambein bis zum Xiphoid-Prozess.
- Ziehen Sie die Bauchdecke mit sterilen Retraktoren aus Büroklammern zurück. Bewegen Sie den Darm mit einem sterilen Wattestäbchen zur rechten Flanke des Bauches (linke Seite des Chirurgen), um die Milz freizulegen. Verätzen Sie die kurze Magenvene, die an der Milz befestigt ist, mit einem sterilen Niedertemperaturkauter (Abbildung 1A). Legen Sie ein Stück sterile, mit 37 °C Kochsalzlösung getränkte Gaze auf die Milz, um sie feucht zu halten (Abbildung 1B).
- Trennen und mobilisieren Sie die Pfortader vom Pankreasgewebe (Abbildung 1C) durch Liligation der Pfortaderäste (Vena pancreaticoduodenalis superior und Vena Magen superior); legen Sie eine Naht um die Pfortader distal der Milzvene (Abbildung 1D).
- Drehen Sie die Milz auf die rechte Seite, um die Aorta und den Zöliakie-Stamm mit der Milzarterie freizulegen (Abbildung 1E). Präparieren und mobilisieren Sie die Aorten-Zöliakie-Milzarterie durch Ligatur der Leberarterie und der Magenarterie; Legen Sie eine Naht um die Aorta proximal der Arteria coeliacus an (Abbildung 1F-G).
- Injizieren Sie 100 internationale Einheiten (IE) Heparin in die untere Hohlvene (IVC), um den ganzen Körper zu heparinisieren, und warten Sie 3 Minuten, um sicherzustellen, dass das Heparin wirkt. Lizieren Sie die Aorta proximal zur Arteria coeliacus, durchtrennen Sie die Pfortader und perfundieren Sie dann den gesamten Körper mit 10 ml heparinisierter Erkältungssalzlösung (4 °C) (10 ml/20 s) von der abdominalen Aorta distal zum Truncus coeliacus (Abbildung 1H).
- Entnehmen Sie das Milztransplantat en bloc mit dem zugehörigen Aorten-Zöliakie-Milzsegment und der Pfortader zusammen mit einem Segment der Milzvene und einem kleinen Teil des Pankreasgewebes. Bewahren Sie das Transplantat vor der Transplantation in 5 ml Kochsalzlösung mit 4 °C auf. Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation.
3. Empfänger-Splenektomie und Milztransplantatimplantation
- Legen Sie ein Heizkissen auf die Operationsplattform und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Legen Sie ein steriles Tuch (45,7 cm x 66 cm) auf das Heizkissen, um eine sterile Operationsplattform zu schaffen. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 zur chirurgischen Vorbereitung und Anästhesie. Machen Sie einen 3-4 cm langen Schnitt in der Mittellinie und ziehen Sie die Bauchdecke zurück, wie in Schritt 2.1 und Schritt 2.2 beschrieben.
- Bewegen Sie den Darm vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen auf die rechte Seite der Maus, um die Milz des Empfängers freizulegen. Lilizieren Sie die Milzvene und die Arterie und entfernen Sie die Milz.
- Schieben Sie den Darm vorsichtig auf die linke Seite der Maus und bedecken Sie den Darm mit feuchter Gaze (getränkt mit steriler 37 °C Kochsalzlösung). Präparieren und ligieren Sie die Lendenäste der infrarenalen Aorta und der IVC; Kreuzklemmen Sie die infrarenale Aorta und die IVC mit zwei 4 mm mikrovaskulären Klemmen.
- Legen Sie eine 11-0-Nylonnaht durch die infrarenale Aorta (volle Dicke) und ziehen Sie sie zurück, um eine elliptische Aortotomie durch einen einzigen Schnitt mit einer Mikroschere zu erzeugen (die Länge sollte dem Durchmesser der Spenderaorta entsprechen, Abbildung 2A). Durchstechen Sie die IVC mit einer 30-G-Nadel, um eine elliptische Venotomie zu erstellen, und verlängern Sie die Öffnung mit einer Mikroschere auf die passende Länge der Spenderpfortader (Abbildung 2A).
- Beseitigen Sie das intraluminale Blut oder Blutgerinnsel (in der Aorta und IVC) mit 500 μl heparinisierter Kochsalzlösung (10 Einheiten/ml).
- Platzieren Sie das Milztransplantat in der rechten Flanke des Bauches der Empfängermaus; identifizieren Sie vorsichtig die Aortenmanschette des Spenders und die Pfortader des Spenders. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Gefäße nicht verdreht sind, bedecken Sie das Milztransplantat mit Gaze, die mit kalter (4 °C) Kochsalzlösung getränkt ist.
- Verbinden Sie die Aortenmanschette des Spenders mit der proximalen und distalen Spitze der Aortatotomie des Empfängers mit zwei Stay-Nähten (11-0 Nylon-Naht, wie unten) (Abbildung 2B, C). Machen Sie eine Anastomose mit 2-3 Bissen durchgehender 11-0 Nylonnähte zwischen der Aortenmanschette des Spenders und der Aortentomie (Vorderwand) des Empfängers (Abbildung 2D). Drehen Sie das Milztransplantat auf die linke Seite des Empfängers; Führen Sie die Anastomose zwischen der Aortenmanschette des Spenders und der Aortomie des Empfängers (Hinterwand) durch (Abbildung 2E).
- Führen Sie eine Anastomose durch, um die Pfortader des Spenders mit der hinteren Wand der IVC des Empfängers zu verbinden, indem Sie 4 bis 5 Bisse kontinuierlicher Nähte auf der Innenseite der IVC verwenden und dann die Naht an der Außenseite der IVC schließen (Abbildung 2F, G).
- Lösen Sie die Gefäßklemmen und tamponieren Sie die Blutungen mit einem sterilen Wattestäbchen, bis die Milzfarbe wiederhergestellt ist (Abbildung 2H).
- Verschließen Sie den Bauch mit einer 5-0 synthetischen resorbierbaren Vicryl-Naht in einem kontinuierlichen Muster. Verschließen Sie die Hautschicht mit einer 5-0 Nylonnaht in einem unterbrochenen Muster.
Anmerkung: Für die Schritte 3.7-3.8 ist alternativ zunächst eine Anastomose zwischen der Pfortader des Spenders und der IVC des Empfängers durchzuführen (Schritt 3.8); Führen Sie dann eine Anastomose zwischen der Aortenmanschette des Spenders und der hinteren Wand der Aortomie des Empfängers durch, indem Sie 2 bis 3 durchgehende Nähte im Inneren der Aorta verwenden und die Naht an der Außenseite der Aorta schließen.
>4. Wiederherstellung von Tieren
- Injizieren Sie 1 ml warme Kochsalzlösung subkutan über 4 separate Stellen (0,25 ml/Stelle), nachdem Sie den Bauch verschlossen haben.
- Bewahren Sie die Maus in den ersten Stunden nach der Operation in einem temperaturgesteuerten Inkubator (30 °C) auf, überwachen Sie die Maus, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, und bringen Sie die Maus dann in einen neuen, sauberen Käfig mit normalem Futter und Wasser, mit einem Heizkissen (30 °C) unter dem Käfig. Halten Sie die Maus nach der Operation in einem separaten Käfig.
>5. Postoperative Schmerztherapie
- Injizieren Sie 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan 24 h und 48 h nach der Operation, um das Analgesieschema aufrechtzuerhalten.
