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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Herstellung von quantifizierten Glycerinbeständen von Bacillus calmette-guerin (BCG), dänischem und Mycobacterium tuberculosis H37Rv
HINWEIS: Alle beschriebenen Protokolle wurden unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe-3 (BSL3) durchgeführt.
- Tauen Sie gefrorene Glycerinbestände von BCG Danish oder H37Rv-Stämmen auf und inokulieren Sie 100 μl in 10 ml 7H9-Medium, ergänzt mit Tween-80 0,05 % (v/v) und ADC (Albumin, Dextrose, Katalase) 10 % (v/v).
- Eine Woche lang unter statischen Bedingungen bei 37 °C inkubieren, bis sich die Kultur in der logaritmischen Phase befindet.
- Skalieren Sie die Bakterienkultur hoch, indem Sie die 10-ml-Kultur auf 200 ml frisches Medium übertragen. Inkubieren Sie für weitere 20 Tage unter statischen Bedingungen.
- In 50-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen und 15 min bei 2500 x g zentrifugieren.
- Überstände entsorgen und das Bakterienpellet im Restvolumen resuspendieren. Geben Sie sterile Glasperlen mit einem Durchmesser von 3 mm in jedes Röhrchen (10 - 15 pro Röhrchen).
- 1 Minute lang kräftig vortexen, um Bakterienklumpen zu dissoziieren. Resuspendieren Sie jedes Pellet in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Tween-80 0,05 % (v/v).
- Lassen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang stehen, damit sich die größten Bakterienaggregate und Glasperlen absetzen können.
Aus - jedem der 4 Röhrchen, die kleine Klumpen und einzelne Bakterien enthalten, werden 9,5 ml Überstand gewonnen und das Volumen in ein einzelnes frisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt (endgültiges Rückgewinnungsvolumen 38 ml). 10 min bei 400 x g zentrifugieren.
- 35 ml Überstand (der hauptsächlich einzelne Bakterien enthält) werden in einem einzigen frischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen gewonnen und 15 ml PBS mit Glycerin 50 % (v/v) hinzugefügt, wodurch eine endgültige Glycerinkonzentration von 15 % (v/v) erreicht wird.
- Vorsichtig mischen und in 1 ml Aliquote in geeigneten Röhrchen zum Einfrieren verteilen. Bei -80 °C lagern (eine Charge enthält ca. 50 Aliquots Glycerinbrühe).
- Um die Glycerinbestände zu quantifizieren, tauen Sie das Glycerin am Tag nach dem Einfrieren auf und führen Sie sieben zehnfache Serienverdünnungen in separaten 1,5-ml-Röhrchen mit 900 μl PBS durch.
- 100 μl jeder Verdünnung in 7H10 Fest-Agar-Medium, zugegeben mit ADC 10 % (v/v), in Petrischalen mit 55 mm Durchmesser auffüllen.
- Fügen Sie vorsichtig Glasperlen mit einem Durchmesser von 3 mm (ca. 10 pro Platte) hinzu und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um das Volumen gleichmäßig auf der Agarplatte zu verteilen. Entsorgen Sie die Kügelchen und versiegeln Sie die Agarplatte mit Parafilm.
- 21 Tage lang bei 37 °C inkubieren und die Bakterienkonzentration durch Zählen der koloniebildenden Einheiten (KBE) in den Verdünnungen bestimmen, in denen einzelne Kolonien genau unterschieden werden können.
>2. Impfung von Mäusen
- Tauen Sie ein vorquantifiziertes BCG-Glycerin auf und verdünnen Sie es in PBS, um zwei Suspensionen herzustellen. Berechnen Sie das endgültige Volumen unter Berücksichtigung der Dosis pro Tier 100 μl für die subkutane Verabreichung (107 KBE pro ml für die subkutane Impfung) und 40 μl für die intranasale Verabreichung (2,5 x 107 KBE für die intranasale Impfung).
- Verwenden Sie einen speziellen Anästhesiearbeitsplatz für Nagetiere, um Mäuse mit einer Mischung aus Isofluran und Sauerstoff zu betäuben. Verwenden Sie 5% Isofluran, um eine Anästhesie einzuleiten, und 2%, um die Mäuse in der Anästhesiekammer zu halten. (Es können auch andere anerkannte Anästhesiemethoden verwendet werden).
- Für die subkutane Verabreichung des Impfstoffs füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 26-g-Nadel mit 1 ml Bakteriensuspension (10,7 KBE/ml). Entfernen Sie Luftblasen.
- Eine anästhesierte Maus wird auf eine ebene Fläche in Bauchlage in einer Laminar-Flow-Haube gelegt und 100 μl (106 KBE/Dosis) Impfstoff subkutan in eine Flanke des Mausrückens inokuliert. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein und überwachen Sie sie, um sicherzustellen, dass sie sich ordnungsgemäß von der Narkose erholt.
- Wechseln Sie die Spritzennadel zwischen jeder Verabreichung mit der Maus. Luftblasen wie oben beschrieben entfernt.
- Für die intranasale Verabreichung legen Sie eine betäubte Maus in Rückenlage in die Haube.
- Mit einer Mikropipette werden 20 μl der Suspension mit 2,5 x 107 KBE/ml entnommen. Das Inokulum wird tropfenweise zwischen die beiden Nasenlöcher gelegt, bis das gesamte Volumen abgelagert ist, wobei zwischen den Tropfen Zeit bleibt, damit die Maus das Volumen einatmen kann.
HINWEIS: Mäuse können während dieses Verfahrens unter Atemnot leiden, daher sollten sie jeden Tropfen assimilieren müssen, bevor sie den nächsten verabreichen, um dies so weit wie möglich zu verhindern.
- Füllen Sie die Mikropipette erneut mit weiteren 20 μl und wiederholen Sie den Vorgang. Wenn die Maus nach der ersten Impfung aus der Anästhesie erwacht, legen Sie sie vor der zweiten Impfung in die Anästhesiekammer. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein und stellen Sie sicher, dass sie sich ordnungsgemäß von der Narkose erholt.
>3. Intranasale Herausforderung der Maus mit H37Rv-Stamm
- Tauen Sie ein vorquantifiziertes H37Rv-Glycerin auf und verdünnen Sie es in PBS, um eine Bakteriensuspension von 2.500 KBE pro ml herzustellen. Berechnen Sie das endgültige Volumen unter Berücksichtigung der Dosis pro Tier von 40 μl.
- H37Rv wird intranasal geimpft, wie in 2.5 - 2.7 beschrieben. Die endgültige Provokationsdosis pro Maus beträgt 102 KBE/40 μl.