Erzeugung der weit verbreiteten zerebralen kortikalen Demyelinisierung in einem Rattenmodell

Zusammenfassung

Quelle: Üçal, M. et al., Rattenmodell der weit verbreiteten zerebralen kortikalen Demyelinisierung, die durch eine intrazerebrale Injektion von proinflammatorischen Zytokinen induziert wird. J. Vis. Exp. (2021)

Das Video demonstriert eine Methode zur Generierung eines Rattenmodells mit weit verbreiteter zerebraler kortikaler Demyelinisierung. Dabei wird die Blut-Hirn-Schranke gestört, indem proinflammatorische Zytokine in Mäuse injiziert werden, die mit rekombinantem Myelinscheidenprotein geprimt sind. Dieser Prozess erleichtert die Infiltration von Immunzellen, was zu einer weit verbreiteten Demyelinisierung der Großhirnrinde führt.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Materialvorbereitung

HINWEIS: Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Vergewissern Sie sich vor dem Start, dass alle chirurgischen Instrumente, einschließlich der Bohrer, mit einem geeigneten Desinfektionsmittel gereinigt werden.

1. Bereiten Sie eine Anästhesiemischung vor: 0,02 mg/ml Fentanyl, 0,4 mg/ml Midazolam und 0,2 mg/ml Medetomidin (Endkonzentrationen in der Mischung).
   HINWEIS: Siehe den entsprechenden Diskussionsabschnitt für alternative Anästhetika.
2. Bereiten Sie eine Gegenmittelmischung vor: 0,07 mg/ml Flumazenil und 0,42 mg/ml Atipamezol (Endkonzentrationen in der Mischung).
3. Montieren Sie den Katheter und die Katheterkappe mit dem Einlass und der Schraube. Schneiden Sie den Katheter mit einem Skalpell auf eine Länge von 2 mm ab (Abbildung 1).
   HINWEIS: Verwenden Sie dafür keine Schere, da diese die kreisförmige Querschnittsform der Katheterspitze zusammendrückt und verzerrt.

>2. Chirurgische Vorbereitung

1. Betäuben Sie die Ratte durch intraperitoneale Verabreichung des Anästhesiegemisches (1,5 ml/kg Körpergewicht).
2. Rasieren Sie den Kopf der Ratte zwischen den Ohren mit dem Elektrorasierer. Legen Sie eine homöotherme Decke auf den stereotaktischen Rahmen, bevor Sie das Tier positionieren, um eine Unterkühlung während der Operation zu vermeiden.
3. Fixieren Sie den Rattenkopf im stereotaktischen Rahmen mit den Ohrstangen und der Beißplatte und stellen Sie sicher, dass der Kopf horizontal und stabil ist. Überprüfen Sie die Stabilität, indem Sie mit dem Finger oder einer Pinzette Druck auf den Schädel ausüben.
   HINWEIS: Eine lockere Fixierung und eine nicht horizontale Positionierung innerhalb des stereotaktischen Rahmens kann zu einer Abweichung von den beabsichtigten Koordinaten führen.
4. Tragen Sie befeuchtende Augentropfen auf, um eine Trockenheit der Hornhaut während der Operation zu verhindern. Decken Sie die Augen mit einem undurchsichtigen Material ab, um eine Exposition gegenüber chirurgischem Licht zu verhindern.
5. Reinigen Sie die rasierte Stelle, indem Sie abwechselnd 70 % Ethanol und 10 % Povidon-Jod-Komplex auftragen.
   HINWEIS: Befolgen Sie alle Vorsichtsmaßnahmen während der Operation, um Infektionen zu vermeiden. Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Wenn die Asepsis gebrochen ist, muss das kontaminierte Material ausgetauscht werden.

>3. Katheter-Implantation

1. Machen Sie einen Längsschnitt von ca. 2 cm Länge in der Mitte der Kopfhaut. Verwenden Sie Bulldoggenklemmen, um die Haut zu den Seiten zu halten. Eine Übersicht über diese Schritte finden Sie in Abbildung 2.
2. Entferne das Blut mit einem Applikator mit Wattespitze.
3. Entfernen Sie das Schädelperiost. Reinigen Sie das Taschentuch mit dem Applikator mit Wattespitze und legen Sie den Schädelknochen frei. Lassen Sie den Schädel ca. 1 min trocknen.
4. Identifizieren Sie die anatomischen Orientierungspunkte, Lambda, Bregma und mediale Naht. Wenn der Bohrer auf dem stereotaktischen Rahmen installiert ist, positionieren Sie die Bohrspitze am Bregma als Ausgangspunkt. Verschieben Sie 2 mm posterior von der Bregma und verschieben Sie ~2,4 mm lateral zur medialen Naht.
5. Bohren Sie an dieser Stelle ein Loch mit einem Durchmesser von 0,5 mm für den Katheter. Pusten Sie den Knochenstaub vorsichtig weg.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Dura Mater während des Bohrens intakt bleibt. Um dies zu gewährleisten, verwenden Sie 1) einen Bohrer, der auf dem stereotaktischen Rahmen installiert werden kann, 2) inspizieren Sie das Loch während des Bohrens häufig und 3) bohren Sie in kleinen Schritten nach unten. Wenn zu viel Druck auf den Schädel ausgeübt wird, dringt die Bohrspitze in das Gehirn ein und schädigt es, wenn der Schädel vollständig durchdrungen ist.
6. Bohren Sie 3 weitere Löcher (~1,3 mm Durchmesser) für die Ankerschrauben wenige Millimeter vom ersten Loch entfernt. Blasen Sie den Knochenstaub vorsichtig weg.
   HINWEIS: Wählen Sie die Positionen der Ankerschrauben, die genügend Platz für die Katheterspitze (~2 mm Durchmesser) und die Ankerschraubenköpfe (~1 mm) bieten.
7. Entfernen Sie den Knochenstaub durch Spülung mit ca. 1 - 2 mL steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder physiologischer Kochsalzlösung mit einer Spritze. Reinige den Schädel. Ziehen Sie die Ankerschrauben um 2 - 3 volle Umdrehungen fest.
   HINWEIS: Die Ankerschrauben sind notwendig, um das Setup zu stabilisieren, indem sie den Zahnzement und damit den Katheter an Ort und Stelle halten. Achten Sie beim Anziehen einer Ankerschraube darauf, dass sie sich nicht leicht lösen lässt, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette nach oben heben. Da die Implantation des Katheters selbst ein Gewebetrauma verursacht, führt eine zusätzliche Duraverletzung beim Bohren oder Festziehen der Ankerschrauben zu multiplen traumatischen Verletzungen und erschwert möglicherweise die Vergleichbarkeit innerhalb einer Gruppe. Ziehen Sie zuerst die Ankerschrauben fest und führen Sie zuletzt den Katheter ein.
8. Führen Sie den 2 mm langen Katheter senkrecht zur Schädeloberfläche durch das erste Loch ein. Während Sie den Katheter noch festhalten, tragen Sie etwas Zahnzement auf und lassen Sie ihn mit einer kurzen (~5 s) Einwirkung des Zahnhärtungslichts polymerisieren, um den Katheter zu stabilisieren, so dass im nächsten Schritt beide Hände verwendet werden können.
   Vorsicht: Vermeiden Sie bei der Arbeit mit einer Zahnhärtelampe den direkten Blick auf die Spitze oder auf das vom Anwendungsbereich reflektierte Licht, da die hohe Intensität dieses Lichts Netzhautschäden verursachen kann. Verwenden Sie eine geeignete Schutzbrille.
9. Tragen Sie mehr Zahnzement um den Katheter auf, verankern Sie die Schrauben und verfestigen Sie den Zahnzement mit der Zahnhärtungslampe (~15 - 30 s). Bestätigen Sie die Aushärtung des Zements mit der Spitze einer Pinzette.

>4. Verschluss der Wunde und Antagonisierung der Anästhesie

1. Die Kopfhaut mit resorbierbaren Nähten front- und posterior des Katheters verschließen.
   HINWEIS: Da am Ende der Implantation ein holpriger Aufbau über dem Schädel entsteht, führen Sie den Wundverschluss entsprechend durch. Wenn Sie die Haut zu stark anheben, führt dies zu Beschwerden für das Tier.
2. Injizieren Sie die Gegenmittelmischung subkutan (1,5 ml/kg Körpergewicht) mit einer 1-ml-Spritze und einer 26-g-Nadel.
3. Verabreichen Sie Enrofloxacin (2,5%) durch subkutane Injektion (7,5 mg/kg Körpergewicht) zur prophylaktischen Antibiotikabehandlung. Verabreichen Sie Carprofen (1 mg/ml; 5 mg/kg Körpergewicht) und Buprenorphin (1,2 mg/kg) zur Schmerzlinderung durch subkutane Injektion.

>5. Nachsorge und Medikation

1. Setzen Sie das Tier in den modifizierten Käfig zurück und halten Sie es 1 - 3 Stunden lang unter Beobachtung, wobei Sie Infrarotlicht anwenden, um Unterkühlung zu vermeiden. Beobachten Sie das Tier ständig und positionieren Sie es alle 5 bis 10 Minuten neu, bis es sich postoperativ erholt hat. Achten Sie besonders darauf, dass die Augen bis zur Genesung nicht ständig mit Licht bestrahlt werden.
2. Wiederholen Sie die Verabreichung von Enrofloxacin (7,5 mg/kg Körpergewicht) und Carprofen (1 mg/ml; 5 mg/kg Körpergewicht) durch subkutane Injektionen am Tag nach der Operation. Buprenorphin muss nicht aufgefrischt werden, da die vorherige Behandlung 72 Stunden lang wirksam ist.

>6. Vorbereitung der Immunisierungsmischung (frühestens 14 Tage nach der Katheterimplantation)

HINWEIS: Legen Sie die Spritzen während des Vorbereitungsvorgangs auf Eis.

1. Verbinden Sie zwei 10-ml-Luer-Lock-Spitzenglasspritzen mit den kurzen Armen eines 3-Wege-Absperrhahns und verschließen Sie den dritten Ausgang mit dem langen Arm.
2. Stellen Sie sicher, dass die Verbindungen sicher und leckagefrei sind: Geben Sie ca. 4 ml steriles PBS in die offene Spritze, während Sie Kolben 2 halten. Kolben 1 einsetzen und beide Kolben hin und her schieben, während Sie auf Undichtigkeit prüfen. Wenn keine Leckage auftritt, entsorgen Sie das PBS und entfernen Sie den Kolben 1 wieder.
3. 1 ml unvollständiges Freund-Adjuvans (IFA) und 50 μg rekombinantes Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (rMOG_1-125) werden zusammen pipettiert und die Mischung auf ein Endvolumen von 2 ml mit sterilem PBS (pH 7,4) in einem geeigneten Röhrchen eingestellt.
   HINWEIS: Aufgrund von Emulsionsverlusten an den Spitzen oder Wänden der Spritzen während der Zubereitung ist ein größeres Volumen als für die Verabreichung vorgesehen vorzubereiten. Ebenso ist es praktischer, sich auf mehr als 1 Tier auf einmal vorzubereiten.
4. Geben Sie die verdünnte Mischung aus IFA und rMOG_1-125 in die offene Spritze. Setzen Sie den Kolben vorsichtig ein, während Sie einen lockeren Druck auf den gegenüberliegenden Kolben ausüben (Abbildung 3A).
5. Emulgieren Sie das Inokulum, indem Sie es von einer Spritze zur anderen treiben, indem Sie die Kolben hin und her schieben, bis es weiß und viskos ist (Abbildung 3B).
6. Befestigen Sie eine 1-ml-Luer-Lock-Spritze am offenen kurzen Arm des 3-Wege-Absperrhahns und füllen Sie ihn mit Inokulum (Abbildung 3C). Verteilen Sie das gesamte Inokulum auf 1-ml-Spritzen. Bewahren Sie es bis zur Injektion auf Eis auf. Verabreichen Sie die Mischung am Tag der Zubereitung.

>7. Immunisierung

1. Betäuben Sie die Ratte mit Isofluran in einer Kammer (~2 min, gemischt mit Sauerstoff 2 L/min) und halten Sie dann die Narkose durch eine Maske (gemischt mit Sauerstoff 1,5 L/min) aufrecht.
2. 200 μl Inokulum subkutan an der Schwanzbasis mit einer 21 G Nadel injizieren.
   HINWEIS: Verabreichen Sie die Injektion langsam, da die Lösung viskos ist.

>8. Intrazerebrale Zytokin-Injektion

1. Passen Sie die Länge der Verbindungskanüle (2 mm) an. (Siehe Abbildung 4 für die Vorbereitungsschritte.)
2. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit dem Zytokingemisch (500 ng/μl Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha), 300 U/μl rekombinantes Ratteninterferon-gamma (IFN-gamma) in sterilem PBS). Verbinden Sie die Spritze mit einer Verbindungskanüle. Füllen Sie die Kanüle mit der Zytokinmischung. Vermeiden Sie Blasen.
3. Montieren Sie die Spritze auf die programmierbare Spritzenpumpe und programmieren Sie sie so, dass sie 0,2 μl/min injiziert (Abbildung 5A). Starten Sie die Pumpe und lassen Sie sie laufen, um eine Luftblasenbildung an der Spitze der Kanüle zu vermeiden.
   HINWEIS: Bei der Injektionsgeschwindigkeit muss der Innendurchmesser der verwendeten Spritze berücksichtigt werden. Dabei muss der Spritzendurchmesser beim Einrichten der Pumpe registriert werden.
4. Betäuben Sie die Ratte mit Isofluran in einer Kammer (~2 min, gemischt mit 2 l/min Sauerstoff) und halten Sie dann die Narkose durch eine Maske (gemischt mit 1,5 l/min Sauerstoff) aufrecht (Abbildungen 5B und 5C). Tragen Sie befeuchtende Augentropfen auf, da das Tier mindestens 30 Minuten lang betäubt wird.
5. Entfernen Sie die Katheterkappe mit dem Einlass. Führen Sie die Konnektorkanüle in den Katheter ein, schrauben Sie sie fest und ziehen Sie sie fest (Abbildungen 5D und 5E).
   HINWEIS: Ziehen Sie ihn nicht zu fest an, da dies die obere Spitze des Katheters zerstört
.
6. Lassen Sie die Injektion 10 Minuten lang fortfahren (das Gesamtvolumen der Injektion beträgt 2 μl). Stoppen Sie die Pumpe. Lassen Sie die Kanüle 20 Minuten lang im Katheter, damit das injizierte Volumen vollständig diffundieren kann.
7. Schrauben Sie die Verbindungskanüle ab und entfernen Sie sie langsam, um einen Vakuumeffekt zu vermeiden.
8. Befestigen Sie die Katheterkappe wieder mit dem Einlass und schrauben Sie sie fest. Lassen Sie das Tier sich in einem Käfig von der Narkose erholen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Vorbereitung des Katheters. (A und B) Die Führungskanüle und die Dummy-Kanüle (Katheterkappe mit Inlet) werden zusammengebaut und verschraubt. (C) Anschließend wird der Katheter mit Hilfe eines Skalpells auf eine Größe von 2 mm geschnitten. Die mikroskopische Beobachtung zeigte, dass die Verwendung einer Schere zu diesem Zweck die kre...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Erwachsene männliche Dark Agouti Ratten (300 ±25 g)
Fentanyl	Hameln pharma plus, Deutschland		Als Fentanyl-Citrat, 50 μg/ml
Midazolam	ERWO Pharma, Österreich	50039017	5 mg/ml
Medetomidin	Orion Pharma, Finnland		Als Medetomidinhydrochlorid, 1mg/ml
Flumazenil	Roche, Schweiz		0,1 mg/ml
Atipamezol	Orion Pharma, Finnland		Als Atipamezolhydrochlorid, 5 mg/ml
10% Povidon-Jod-Komplex	Mundipharma, Österreich
Zahnzement	Heraeus Kulzer, Deutschland	Tel.: 6603 7633
Physiologische Kochsalzlösung	Fresenius Kabi, Österreich		0,9 % NaCl
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich, Deutschland	Nr. P3813
Isofluoran	AbbVie, Österreich
Befeuchtende Augentropfen	Thea Pharma, Österreich
70% EtOH	Merck, Deutschland	1070172511	Absolutes Ethanol wurde in ddH2O verdünnt, um es zu 70 % v/v
2,5 % Enrofloxacin	Bayer, Deutschland		Prophylaktische Antibiotika
Carprofen	Pfizer, Vereinigte Staaten von Amerika		Schmerzmittel, 50 mg/ml
Tween-20	Sigma-Aldrich, Deutschland	Nr. P9416
Pentobarbital	Richter Pharma, Österreich		Pentobarbital-Natrium, 400 mg/ml
Interferon-Gamma	PeproTech, Vereinigte Staaten von Amerika	400-20
Tumornekrosefaktor alfa	F&E-Systeme, USA	510-RT-050/CF
rMOG1-125	eigenes Produkt am Zentrum für Molekulare Medizin, Karolinska Institut, Schweden		Rekombinantes Rattenmyelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein, Aminosäuren 1-125 aus dem N-Terminus, auch kommerziell erhältlich: AnaSpec, AS-55152-500, USA
Unvollständiges Freund-Adjuvans	Sigma-Aldrich, Deutschland	Nr. F5506
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich, Deutschland	Nr. A9576
Peroxidase-Substrat-Lösung	Vector Laboratories, USA	SK-45000
Stereotaktischer Rahmen	David Kopf Instruments, USA
Katheter, MRT-geeignet	PlasticsOne, Vereinigte Staaten von Amerika	8IC315GPKXXC
Dummy-Kanülen	PlasticsOne, Vereinigte Staaten von Amerika	8IC315DCNSPC
Kunststoffschrauben, MRT-geeignet	PlasticsOne, Vereinigte Staaten von Amerika	8L080X093N01
Konnektor-Kanüle	PlasticsOne, Vereinigte Staaten von Amerika	8IC313CXSPCC
Schraubendreher mit 2 mm Spitzenweite
Bohrer mit flexibler Schaftverlängerung	Proxxon, Deutschland	NR. 28 472, NR. 28 706, NR. 28 620,
Bohrer, rund, 0,5 mm	Hager & Meisinger, Deutschland	REF310 104 001 001 009
Bohrer, gedreht, 1,3 mm	Hager & Meisinger, Deutschland	REF350 104 417 364 013
Skalpell	Braun, Deutschland	BB510
Skalpell-Griff	Fine Science Tools, Deutschland	Artikel-Nr.: 91003-12
Applikator mit Wattestäbchen	Henry Schein Medical, Österreich	900-3155
Chirurgische Schere	Fine Science Tools, Deutschland	14101-14, 14088-10
Chirurgische Zange	Fine Science Tools, Deutschland	Nr. 11002-12, 11251-35
Bulldog-Klemmen	Fine Science Tools, Deutschland	Nr. 18050-35
Homöotherme Decke	TSE-Systeme, Deutschland
Infrarot-Lampe	Beurer, Deutschland	616,51
Zahnhärtendes Licht	Guilin Woodpecker Medical, China
Resorbierbares Nahtmaterial	Johnson & Johnson, Belgien	V792E
Programmierbare Spritzenpumpe	World Precision Instruments, USA	AL-1000
Untersuchungshandschuhe
OP-Kittel
Elektrorasierer	Aesculap, Deutschland	GT420
Verdampfer für flüchtige Anästhetika	Rothacher Medical, Schweiz	CV 30-301-D
Sauerstoffquelle für flüchtige Anästhesieverdampfer	Air Liquide, Österreich	19.113
Flüchtige Anästhesiekammer	Rothacher Medical, Schweiz	Nr. PS-0347
Anästhesiemaske für Ratten	Rothacher Medical, Schweiz	PS-0307-A
1 ml Spritze	Codan, Dänemark	REF 62.1612
26 Gauge Nadel für die Injektion	Braun, Deutschland	4657683
20 Gauge Nadel für Zytokininjektion und Immunisierung	Braun, Deutschland	4657519
Glasspritzen mit Luer-Lock-Spitze	Poulten & Graf, Deutschland	7.140-37
3-Wege-Absperrhahn	Becton Dickinson, Schweden	Artikel-Nr.: 394600
37°C Inkubator	Kendro, Deutschland	50042301
Mikropipetten	Gilson, Vereinigte Staaten von Amerika	F167350

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