Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Sterilisation
- Desinfizieren Sie die Pinzette vor der Entnahme der Köpfe, indem Sie eine saubere Pinzette nehmen und eine Sterilisation bei trockener Hitze in einem Ofen bei 200 °C für 1 h durchführen. Autoklavieren Sie alle Glaswaren vor dem Gebrauch 15 Minuten lang bei 121 °C.
- Führen Sie alle beschriebenen Arbeiten in einem Schrank der Mikrobiologieklasse 2 durch. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
>2. Probenentnahme
- Im Schlachthof wurden Swaledale-Lämmer durch Betäubung mit Elektroschock oder einer Bolzenschusspistole geschlachtet und ausgeblutet. Die Lammköpfe werden spätestens 4 Stunden nach der Schlachtung eingesammelt.
>3. Vorbereitung der Köpfe
- Desinfizieren Sie den Stirnbereich des Lammes, indem Sie ca. 100 ml 200 ppm Chlordioxidlösung auf den Probenbereich gießen. Rasieren Sie die Stirnpartie des Kopfes mit einer elektrischen Haarschneidemaschine und waschen Sie den Bereich mit 200 ml 200 ppm Chlordioxidlösung.
- Wischen Sie den Bereich mit Ethanol und blauer Rolle ab und bedecken Sie den Probenbereich 35 Minuten lang mit Haarentfernungscreme. Kratzen Sie die Haarentfernungscreme vorsichtig mit einem Schaberwerkzeug ab und beurteilen Sie den Probenbereich. Wenn eine signifikante Menge an Haaren übrig bleibt, wiederholen Sie den Haarentfernungsvorgang.
- Verwenden Sie weitere 200 ml Chlordioxidlösung, um den Bereich abzuspülen, spülen Sie dann mit Ethanol ab und wischen Sie ihn mit einer blauen Rolle ab.
- Schneiden Sie mit einem sterilen 8-mm-Biopsienstanzer 8 mm große Hautproben aus dem vorbereiteten Bereich aus. Entnehmen Sie die Proben mit einer sterilen Pinzette und einem Skalpell mit 15 Klingen und stellen Sie sicher, dass das gesamte Hautfett entfernt wird.
- Geben Sie die Proben in ein steriles 0,5-l-Glas, das mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, und geben Sie sie dann in sterile 50-ml-Röhrchen mit 50 mL 200 ppm Chlordioxidlösung, indrehen Sie sie zweimal um und lassen Sie sie 30 Minuten lang sterilisieren.
- Nehmen Sie die Proben aus der Chlordioxidlösung und waschen Sie sie, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen geben, das mit 40 mL sterilem PBS gefüllt ist. Legen Sie nach dem Waschen jede einzelne Hautprobe in eine separate Vertiefung einer 24-Well-Platte.
- Fügen Sie 350 μl vorgewärmtes Medium hinzu, während die Probe an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche bleibt. Die Zusammensetzung des Mediums ist wie folgt: MK-Medium (Medium 199 mit Hanks-Salzen, L-Glutamat und 1,75 mg/ml Natriumbicarbonat) und Ham's F12 im Verhältnis 1:1, mit Zusatz von fötalem Rinderserum (FBS, 10 % v/v), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, 10 ng/ml), Insulin (5 μg/ml), Penicillin-Streptomycin (100 U/ml), und Amphotericin B (2,5 μg/ml).
- Verschließen Sie die 24-Well-Platten mit einer gasdurchlässigen Plattenversiegelung und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5 %CO 2 -Gewebeinkubator für bis zu 24 Stunden.
>4. Pflege von Hautproben
- Entfernen Sie nach der Inkubation das Kulturmedium und spülen Sie die Proben in 500 μl steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Geben Sie jeder Probe antibiotikafreie Medien hinzu und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Gewebeinkubator, um Antibiotikareste in der Probe zu entfernen.
- Wenn sich nach 24 h Trübungen oder Pilzinfektionen in den antibiotikafreien Medien entwickeln, ist die Probe zu entsorgen.
>5. Vorbereitung des Inokulums
- Bereiten Sie ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml steriler tryptischer Sojabrühe vor. Nehmen Sie eine frische Agarplatte mit S. aureus und geben Sie mit einem Tupfer mehrere Völker in die Brühe. 18 h bei 37 °C bei 150 U/min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 4.000 x g. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL sterilem PBS. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal, um eine ausreichende Reinigung der Zellen zu gewährleisten.
- Stellen Sie das Inokulum auf 0,6 OD600 in sterilem PBS ein. Bestätigen Sie die Inokulumbelastung, indem Sie eine manuelle Zählung der lebensfähigen Platten durchführen.
>6. Infektion von Hautproben
- Bereiten Sie eine frische 24-Well-Platte mit 400 μl vorgewärmtem antibiotikafreiem Medium vor und fügen Sie die 24-Well-Einsätze mit einer sterilen Pinzette hinzu.
- Entfernen Sie das Medium von den Hautproben, waschen Sie es mit 500 μl sterilem PBS und entfernen Sie die Wäsche. Halten Sie die Probe mit einer sterilen Pinzette vorsichtig auf den Boden der Vertiefung.
- Verwenden Sie eine 4-mm-Stanzbiopsie, um einen zentralen Wundlappen zu machen, der bis zu einer groben Tiefe von 1-2 mm durchsticht. Verwenden Sie dann ein Skalpell mit 15 Klingen und eine sterile gezahnte Allis-Gewebezange, um die oberste Schicht des Wundlappens zu entfernen. Variabilität in den Wunddimensionen kann das Ergebnis der Infektion und den Endpunkt der koloniebildenden Einheiten (KBE) beeinflussen.
- Sobald alle Proben verwundet sind, übertragen Sie sie mit einer sterilen Pinzette in die 24-Well-Einsätze. Pipettieren Sie 15 μL des bakteriellen Inokulums in das Wundbett. Anschließend 24 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebeinkubator mit 5 % CO2 inkubieren.
- Wenn längere Inkubationszeiten erforderlich sind, entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es alle 24 Stunden durch frisches Medium und inkubieren Sie es unter den gleichen Bedingungen.
