Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Reinigung und Expansion menschlicher NK-Zellen
- Isolieren Sie mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus Buffy Coat.
- Schicht 35 mL Buffy-Coat-Probe auf 15 mL Ficoll-Paque.
- Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 20 Minuten ohne Bremse und sammeln Sie die PBMC von der Grenzfläche.
- Waschen Sie die zurückgewonnenen PBMCs dreimal, indem Sie mindestens das gleiche Volumen PBS hinzufügen, 5 Minuten lang bei 400 x g zentrifugieren und die PBC-Wäsche aspirieren. Die NK-Zelle kann in diesem Stadium durch RosettenSep.
- Expandieren Sie NK-Zellen durch Stimulation mit bestrahlten 10 x 106 mbIL21-exprimierenden Feederzellen an den Tagen 0, 7 und 14. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch frisches RPMI, das 10 % FBS, 1 % Glutamin, 1 % Penicillin, Streptomycin und 100 IE/ml IL-2 für das gesamte Medienvolumen enthält.
>2. gRNA-Design und -Auswahl
- Wählen Sie die spezifischen genomischen Loci aus, auf die Sie abzielen möchten, indem Sie Online-Tools verwenden, z. B. NCBI, Ensemble.
Beispiel.
Beschreibung: Transformierender Wachstumsfaktor Beta-Rezeptor 2 (TGFBRR2) Ektodomäne
Datensatz anzeigen: PF08917
InterPro ansehen: IPR015013
Position: 49 - 157 aa
Zielsequenz: Exon 4 des TGFBR2-Gens (ENSG00000163513)
- Um die gRNAs zu entwerfen, verwenden Sie CRISPR-Design-Web-Tools wie http://crispr.mit.edu und "Benchling".
- Geben Sie die in Schritt 2.1 ausgewählte DNA-Sequenz ein. Wählen Sie den Menschen (hg 19) als Zielgenom. CRISPR-Guides (20 Nukleotide, gefolgt von einer Protospacer Adjacent Motif (PAM)-Sequenz: NGG) werden von der zuvor eingegebenen Sequenz gescannt. Es zeigt auch mögliche Off-Target-Übereinstimmungen im gesamten ausgewählten Genom an.
- Wählen Sie die drei besten gRNAs mit der höchsten Punktzahl aus, basierend auf ihren On-Target- und Off-Target-Raten. Tabelle 1 zeigt beispielsweise die designten CRISPR-RNAs, die auf Exon 4 des TGFBR2-Gens abzielen, die von CRISPR-Design-Webtools vorgeschlagen wurden.
- Bestellen Sie die CRISPR-RNAs als synthetische sequenzspezifische crRNAs.
- Bestellen Sie eine konservierte, transaktivierende RNA (tracrRNA), um durch partielle Homologie mit der crRNA zu interagieren.
>3. Primer für das Design-Deletions-Screening
- Entwicklung von Primern, die die gRNA-Spaltstellen für den T7E1-Mutationsassay umfassen.
- Verwenden Sie Primer in einem Abstand von mindestens 100 bp von der vorhergesagten Spaltstelle, um sicherzustellen, dass nach dem Mutationstest kleine Insertions-Deletions-Passagen (Indels) an der sgRNA-Zielstelle auf 1,5 % Agarosegel erscheinen. Tabelle 2 zeigt die Primer, die zur Amplifikation der TGFBR2-Ektodomäne verwendet werden.
>4. Transduktion von menschlichen primären und expandierten NK-Zellen
Hinweis: Die Transduktion von Cas9/RNPs-Elementen in NK erfolgt durch Elektroporation mit dem 4D-System wie folgt.
- Vorbereitung der Zellen
- Für primäre NK-Zellen inkubieren Sie frisch isolierte NK-Zellen in Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) in Gegenwart von 100 IE/ml IL-2 für 4 Tage und führen Sie die Elektroporation an Tag 5 durch. Tauschen Sie das Medium jeden zweiten Tag aus, wie zuvor beschrieben und am Tag vor der Transduktion.
- Bei expandierten NK-Zellen stimulieren Sie die Zellen am Tag 0 mit bestrahlten Feederzellen im Verhältnis 1:1 und führen Sie die Elektroporation an Tag 5 oder 6 oder 7 durch. Tauschen Sie das Medium jeden zweiten Tag aus, wie zuvor beschrieben und am Tag vor der Transduktion.
- Bereiten Sie am Tag der Elektroporation einen T25-Kolben vor, der mit 8 ml frischem RPMI gefüllt ist, der 100 I.E./ml IL-2 enthält, für Zellen, die einer Elektroporation unterzogen werden, und inkubieren Sie Kolben in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 <>
Anmerkung: Aufgetaute Zellen oder Zellen, die eine 2. oder 3. Stimulation erfahren haben, können nach ihrer Genesung jederzeit wie beschrieben elektroporiert werden.
- Nehmen Sie 3 - 4 × 106 Zellen pro Bedingung für 26 μl Transduktionsmischung.
Anmerkung: Eine sehr hohe Konzentration von NK-Zellen in Elektroporationslösung erhöht die Transduktionsrate.
- Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS, um alle FBS zu entfernen, die häufig RNase-Aktivität enthalten. Schleudere sie jedes Mal bei 300 x g für 8 Minuten herunter.
Anmerkung: Betrachten Sie 7 Elektroporationsbedingungen für Cas/RNPs als einzelne gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) und eine Kombination aus zwei gRNAs (gRNA1+gRNA2, gRNA1+gRNA3, gRNA2+gRNA3) und einer Kontrolle ohne Cas9/RNPs.
- Bilden Sie den crRNA:tracerRNA/Komplex
- Resuspendieren Sie crRNAs (gRNA1, gRNA2 und gRNA3) und tracerRNA in 1x TE-Lösung auf Endkonzentrationen von 200 μM. Mischen Sie 2,2 μl jeder 200 μM gRNA mit 200 μM tracerRNA, wie in Tabelle 3 gezeigt.
- Die Proben 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzen und auf der Tischplatte auf Raumtemperatur (15 - 25 °C) abkühlen lassen. Resuspendierte RNAs und crRNA: tracrRNA/Komplex zur späteren Verwendung bei -20 °C lagern.
- Bilden Sie den RNP-Komplex
Hinweis: Um Zeit zu sparen, formen Sie den RNP-Komplex während des Waschschritts 4.1.5.
- Für eine einzelne crRNA:tracrRNA-Duplexreaktion verdünnen Sie die Cas9-Endonuklease auf 36 μM, wie im Beispiel in Tabelle 4 gezeigt.
- Für die Kombinationstransduktion von crRNA:tracrRNA-Duplexen verdünnt die Cas9-Endonuklease auf 36 μM, wie im Beispiel in Tabelle 5 gezeigt.
- Geben Sie Cas9-Endonuklease langsam zu crRNA:tracrRNA-Duplexen, während Sie die Pipettenspitze schwenken, über 30 s bis 1 Minute.
- Die Mischung bei Raumtemperatur 15 - 20 min inkubieren. Wenn Sie die Mischung nach der Inkubation nicht verwenden möchten, bewahren Sie die Mischung bis zur Verwendung auf Eis auf.
- Elektroporation
- Geben Sie das gesamte Präparat in die Elektroporationslösung P3 und bewahren Sie es bei Raumtemperatur auf.
- Das Zellpellet (3 - 4 × 106 Zellen aus Schritt 4.1.5) wird in 20 μl P3 primärer 4D-Elektroporationslösung resuspendiert. Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren.
Hinweis: Die Zellen sollten nicht längere Zeit in der P3-Lösung belassen werden.
- Geben Sie sofort 5 μl RNP-Komplex (Schritt 4.3) in die Zellsuspension.
- Fügen Sie 1 μl 100 μM Cas9 Elektroporationsverstärker zum Cas9/RNPs/Zell-Mix hinzu.
- Cas9/RNPs/Zellmischung in 20 μl Elektroporationsstreifen übertragen.
- Klopfen Sie vorsichtig auf die Streifen, um sicherzustellen, dass die Probe den Boden der Streifen bedeckt.
- Starten Sie das 4D-Elektroporationssystem und wählen Sie das Programm EN-138.
Tabelle 1. Drei entworfene gRNAs zielen als synthetische crRNA auf das Exon 4 der TGFBR2-Ektodomäne ab.
| gRNA-Nr. | gRNA-Sequenz | Bestellt als synthetische crRNA |
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | /AltR1/rArGrUrCrArUrGrArGrUrArGrArGrGrCrUrArUrGrGrCrU/AltR2/ |
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | /AltR1/rArUrUrGrCrCrArCrUrCrArArGrArGrGrCrUrArGrUrArGrArGrGrCrUrArUrUrGrCrU/AltR2/ |
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | /AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrA rGrArArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/ |
Tabelle 2. Primer zur Amplifikation des TGFBR2-Ektodomänen-Gens
| TGFBR 2 Ektodomäne Primer FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 Ektodomäne Primer REV | 5 GGG CCT GAG AAT CTG CAT TTA 3 |
Tabelle 3. Bildung des crRNA:tracrRNA/Komplexes aus 200 μM RNAs
kg
| Bestandteil | Menge (uL) |
| 200 μM crRNA | 2.2 |
| 200 μM Tracer-RNA | 2.2 |
| IDTE-Puffer | 5,6 |
| Endprodukt | 10 |
Tabelle 4. Für eine einzelne crRNA:tracrRNA-Duplexreaktion verdünnen Sie die Cas9-Endonuklease auf 36 μM.
| Bestandteil | Menge (μL) |
| Pbs | 1 |
| crRNA:tracrRNA-Duplex (aus Schritt 4.2) | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9-Endonuklease (61 μM Stamm) | arabische Ziffer |
| Gesamtvolumen | 5 UL |
Tabelle 5. Für die Kombinationstransduktion von crRNA:tracrRNA-Duplexen verdünnen sie die Cas9-Endonuklease auf 36 μM.
| Bestandteil | Menge (μL) |
| Pbs | 1 |
| crRNA:tracrRNA-Duplex (z. B. gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA-Duplex (z. B. gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9-Endonuklease | arabische Ziffer |
| Gesamtvolumen | 5 μL |
