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>1. Erzeugung von rekombinanten abgeschwächten Lebend-Influenza-Impfstoffen durch reverse Genetik
HINWEIS: Das detaillierte Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Influenzaviren durch reverse Genetik wurde in früheren Studien beschrieben und liegt außerhalb des Rahmens dieses Berichts. Kurz gesagt, die Rettung von kälteadaptierten Grippeimpfstoffen (CAV) erfolgt in einem Schrank der Biosicherheitsklasse II unter Eindämmung der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) und umfasst die im Folgenden beschriebenen Schritte.
- Generieren Sie einen erkältungsadaptierten Influenza-Impfstoff mit dem Erkältungs-adaptierten Stamm A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) sowie dem Hämagglutinin (HA) und einer modifizierten Neuraminidase (NA) des Stammes A/PR/8/34 (H1N1) als Hintergrund (Abbildung 1A). Die Modifikation im NA-Gen besteht aus einem PCR-basierten Ersatz einer konservierten Sequenz im Proteinstiel (Reste 65 bis 72) durch eine kurze cDNA-Sequenz, die für das von Hühnereialbumin (OVA) abgeleitete Peptid SIINFEKL kodiert (Abbildung 1B). Das SIINFEKL-Peptid ist ein hochimmundominantes Peptid im Rahmen der H-2b MHC-Klasse I-restriktiven Antwort von C57BL/6-Mäusen.
- Platte 10:6 293T-Zellen pro Well in 6-Well-Platten mit DMEM, 10 % fötalem Rinderserum (FBS), ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (P/E).
- Plasmid-Transfektionsgemisch vorbereiten: 1 μg jedes Plasmids, das für cDNAs für PB2, PB1, PA, NP, M, NS aus dem Influenzastamm A/Ann Arbor/6/60 kodiert, und 1 μg der Plasmide, die für NA-SIINFEKL und HA kodieren, aus Influenza A/PR/8/34 hinzufügen. Fügen Sie vorgewärmtes Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) hinzu (15 μl für ein Endvolumen von 100 μl/Well).
- Inkubieren Sie die Transfektionsmischung für 30 Minuten bei RT.
- 100 μl Transfektionsmix/Vertiefung zugeben und 16 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Wechseln Sie das Zellmedium mit DMEM 0,3 % BSA, 1 % P/E bei 33 °C und 5 % CO2 für 5 Stunden.
- 106 Influenza-permissive Madin-Darby-Zellen der Hundeniere (MDCK) sind in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu geben, das 1 μg/ml Trypsin aus der Rinderpankreas enthält, die mit L-1-Tosylamid-2-phenylethylchlormethylketon (TPCK-Trypsin) behandelt wurde. Halten Sie die 293T-MDCK-Co-Kulturen 2 - 3 Tage lang bei 33 °C und 5 % CO2
.
- Überstände von MDCK-293T-Zell-Cokulturen sammeln und durch Zentrifugation bei 260 x g für 5 min klären.
