Ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell der Infiltration von T-Zellen in Tumor-Sphäroiden

Zusammenfassung

Quelle: Lin, Y., et al. Überwachung der Invasion von Krebszellen und der Zytotoxizität von T-Zellen in 3D-Kulturen. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Etablierung einer dreidimensionalen Co-Kultur von Tumor-Sphäroid und T-Zell. Es wird ein Agarose-Abguss mit Mikrovertiefungen hergestellt, die Tumor-Sphäroide enthalten, gefolgt von der Zugabe von T-Zellen. Nach der Inkubation ermöglicht dieser Aufbau die Untersuchung der Interaktion von T-Zellen mit Tumorsphäroiden in einer kontrollierten dreidimensionalen Umgebung.

Protokoll

>1. Erzeugung von Sphäroiden

1. Bereiten Sie 2 % Agarose in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor und autoklavieren Sie sie (z. B. 1 g Agarose in 50 mL 1x PBS) und autoklavieren Sie 35- und 81-Mikrotiter-Gummiformen.
   Vorsicht: Vermeiden Sie die Verwendung von niedrigschmelzender Agarose zur Herstellung der Agarose-Güsse für die Immunhistochemie (IHC).
2. Agarose-Güsse vorbereiten
   HINWEIS: 35-Mikrotiter-Abgüsse werden für Invasions-, Immunfluoreszenz- (IF) und Zellisolationsassays verwendet. 81-Mikrotiter-Abgüsse werden für Zytotoxizitäts-, IHC-, Zellisolierungs- und Ribonukleinsäure-Extraktionsassays (RNA) verwendet.
   1. Nach dem Autoklavieren der Agarose die geschmolzene Agarose auf ca. 60 bis 70 °C abkühlen lassen. Verwenden Sie in einer Zellkulturhaube eine aseptische Technik und pipettieren Sie 500 μl geschmolzene Agarose in eine 81-Mikrowell-Gummiform pro Vertiefung oder 330 μl in eine 35-Mikrowell-Gummiform pro Vertiefung.
      Vorsicht: Vermeiden Sie die Bildung von Blasen beim Mischen oder Pipettieren von Agarose. Entfernen Sie alle Blasen durch vorsichtiges Pipettieren.
   2. Nachdem die Agarose erstarrt ist, biegen Sie die Gummiform vorsichtig, um den Agaroseguss daraus zu entfernen. Legen Sie dabei die Hände über die entsprechende Vertiefungsplatte und lassen Sie den Agaroseguss direkt in eine Vertiefung der Vertiefungsplatte fallen.
      Anmerkung: Biegen Sie die Gummiform an verschiedenen Positionen, um ein Überbiegen zu vermeiden. Es kann hilfreich sein, die Gummiform zu biegen und gleichzeitig sanft von unten zu drücken.
   3. Um die Agaroseabgüsse zu äquilibrieren, fügen Sie Zellkulturmedium hinzu, bestehend aus Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (2,5 ml/Well für 12-Well-Platten und 1 ml/Well für 24-Well-Platten). Die Well-Platte in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) geben und 1 h inkubieren.
3. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Zellkultur für die Aussaat vor.
   Anmerkung: Die Gesamtzahl der Zellaussaat pro Agaroseabguss ist vom Untersucher zu bestimmen. Für murine primäre Pankreaskarzinom-Zelllinien werden 35.000 Zellen/35-Mikrotiterplatten-Cast und 81.000 Zellen/81-Mikrowell-Cast (durchschnittlich 1000 Zellen/Sphäroide) für alle folgenden Assays ausgesät. Der durchschnittliche Durchmesser eines Sphäroids beträgt nach 48 h etwa 150 bis 200 μm.
4. Entfernen Sie das Zellkulturmedium, das den Agaroseguss umgibt, zuerst mit einer P1000-Pipette, indem Sie die Well-Platte kippen. Entfernen Sie dann vorsichtig das Medium in der Saatkammer.
5. Die vorbereitete Tumorzellsuspension vorsichtig tropfenweise in die Zellaussaatkammer aussäen. Setzen Sie die Well-Platte vorsichtig für 15 min.
   in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) zurück Anmerkung: Während dieses Schritts siedeln sich die Zellen in den Mikrovertiefungen des Agarose-Gipses an.
6. Geben Sie zusätzliches Medium an die Außenseite des Agarose-Gusses (2,5 ml/Vertiefung für die 12-Well-Platte und 1 ml/Vertiefung für die 24-Well-Platte).
7. Legen Sie die Well-Platte für 48 h.
   wieder in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) Anmerkung: In der Regel dauert es bis zu einigen Stunden, bis die Zellen in den Mikrowells Sphäroide bilden. Im Allgemeinen werden solide Tumorzell-Sphäroide nach 24 h gebildet und sind nach 48 h stabil. Dies kann jedoch zwischen verschiedenen Zelllinien variieren. Wechseln Sie bei Bedarf das Zellkulturmedium, indem Sie die Well-Platte mit den Agarose-Abgüssen vorsichtig kippen und das umgebende Zellkulturmedium mit einer P1000-Pipette entfernen. Fügen Sie dann vorsichtig frisches Medium hinzu, indem Sie es entlang der Wand der Vertiefung pipettieren. In der Regel ist es nicht notwendig, das Medium innerhalb der Abgüsse zu wechseln, da es ein geringes Volumen hat und die Gefahr besteht, dass die Sphäroide entfernt werden.

>2. Co-Kultur mit T-Zellen

1. Resuspendieren Sie die erforderliche Anzahl von T-Zellen in 75 μl (35-Mikrotiterplatten) oder in 190 μl (81 Mikrotiterplatten) des entsprechenden T-Zell-Kulturmediums (RPMI, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin).
2. Entfernen Sie zuerst das Zellkulturmedium, das den Agaroseguss umgibt, mit einer P1000-Pipette, indem Sie die Well-Platte kippen. Entfernen Sie dann langsam und vorsichtig das Medium aus dem Gips, indem Sie mit einer P200-Pipette vorsichtig auf eine Ecke der Saatkammer abzielen, während Sie die Well-Platte mit der anderen Hand gekippt halten.
3. (Kritischer Schritt 1) Da das Risiko besteht, Sphäroide zu entfernen, kontrollieren Sie den Verlust von Sphäroiden, indem Sie die Anzahl der Sphäroide in den Mikrovertiefungen vor und nach der Entfernung des Mediums vergleichen, indem Sie es unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung betrachten.
4. Säen Sie die T-Zell-Suspension vorsichtig tropfenweise in die Aussaatkammer des Agarose-Abgusses, indem Sie die P200-Pipette etwa 0,5 cm über den Abguss halten.
5. (Kritischer Schritt 2) Es besteht die Gefahr, dass die Sphäroide beim Hinzufügen der T-Zellen ausgeschwemmt werden. Daher ist es wichtig, die T-Zellen sehr langsam und etwa 0,5 cm über der Aussaatkammer hinzuzufügen.
   Anmerkung: Eine Möglichkeit, die Anzahl der ausgespülten Sphäroide zu verringern, besteht darin, die Pipette auf eine Ecke der Aussaatkammer zu richten, während die T-Zellen hinzugefügt werden, wodurch nur das Risiko besteht, dass die Sphäroide in dieser Ecke ausgespült werden.
6. Legen Sie die Well-Platte vorsichtig für 15 min zurück in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO₂).
7. Nehmen Sie die Vertiefungsplatte aus dem Inkubator und fügen Sie frisches Zellkulturmedium (Roswell Park Memorial Institute Media (RPMI) ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin) um den Agarose-Guss hinzu, indem Sie es langsam entlang der Wand der Vertiefung pipettieren.
8. Legen Sie die Well-Platte für 48 h zurück in den Zellkultur-Inkubator.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3D-Petrischalen	Mikrogewebe Inc	Z764019 & Z764051	in den Protokollen als "Gummiformen" bezeichnet; 81-Mikrowell- und 35-Mikrowell-Formen
8-Well-Kammer-Objektträger	Labor-Tek	154534
Agarose Typ I, niedriger EEO	Sigma-Aldrich	Nr. A6013
DMEM, fötales Rinderserum	ThermoFisher	11965092, 16000044	in den Protokollen als "Zellkulturmedium" bezeichnet
RPMI	ThermoFisher	11875093	für T-Zell-Kulturmedium