Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Ablauf der Akufektion
HINWEIS: Die optimale Menge an DNA und die Fläche der Zielhautoberfläche können für verschiedene Gene variieren und müssen weiter optimiert werden. Die Stichkraft und die Anzahl der Male, mit denen die Hornschicht der Haut gelöst wird, können ebenfalls je nach Hautdicke variieren. Diese Bedingungen müssen nach der Evaluierung des Expressionsniveaus von akufektionierten Gentranskripten mittels qRT-PCR sorgfältig bestimmt werden.
- Die Mäuse werden gewogen und Tribromethanol (400 μg pro g Körpergewicht) durch Peritonealinjektion verabreicht.
HINWEIS: 2,2,2-Tribromethanol ist ein injizierbares Anästhetikum, das häufig bei Mäusen verwendet wurde. Lösungen werden hergestellt, indem ein nichtpharmazeutisches 2,2,2-Tribromethanol (2,5 g) in destilliertem Wasser (200 ml) gelöst wird, das 2,5 % 2-Methyl-2-butanol enthält.
- Verwenden Sie veterinärmedizinische Augensalbe, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
Anmerkung: Die anästhetische Wirkung wird in 1 - 2 min induziert. Überprüfen Sie vor der Operation den Zehenquetschreflex, um eine ausreichende Anästhesietiefe zu gewährleisten.
- Rasieren Sie die dorsale Flankenhaut und tragen Sie eine Enthaarungscreme auf, um Keratinproteine im Haarschaft aufzulösen.
Anmerkung: Die Verwendung von Enthaarungscreme zur Entfernung von Haaren erleichtert die Infusion von DNA in die Haut.
- Wischen Sie die Enthaarungscreme mit wassergetränkten Wattebällchen ab.
Anmerkung: Die Enthaarungscreme ist wasserlöslich. Das vollständige Entfernen der Creme verhindert eine fettige Oberfläche und sorgt für ein besseres Einstichergebnis.
- Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, das in 70%igem Ethanol getränkt ist, um die Hautoberfläche zu desinfizieren.
- Markieren Sie den Zielbereich (1 cm x 1 cm) auf der enthaart Haut mit einer vorgemessenen Schablone. Anmerkung: Das Markieren der Zielstelle hilft dabei, das Nadelbündel innerhalb eines definierten Bereichs auf und ab aufzubringen. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass die gleiche Menge an DNA auf eine bestimmte Oberfläche abgegeben wird, um die Variation von Experiment zu Experiment zu minimieren.
- Geben Sie einen 10 μl Tropfen Plasmid-DNA (10 μg) auf die markierte Haut.
Anmerkung: Die Menge an DNA für die Akution variiert je nach Gen und Art des Expressionsvektors. Die verwendete DNA-Menge sollte sorgfältig titriert werden, bevor das interessierende Experiment durchgeführt wird. Die 10 μL sind ein kleiner Flüssigkeitstropfen und sie sitzen gut auf der rasierten und enthaarten Haut, ohne beim Einstechen herunterzurollen. Eine Kontrollgruppe von Mäusen, die mit 10 μl leerer Vektor-DNA behandelt wurden, wird mit Mäusen verglichen, die mit dem Studiengen akufiert wurden.
- Halten Sie das Akupunkturnadelbündel (Abbildung 1B) und stechen Sie mit einer Auf- und Abbewegung 100 Mal in die markierte Oberfläche oder bis die Feuchtigkeit der DNA in PBS auf der Haut verschwindet. Anmerkung: Es kann zu einer gewissen Rötung der Hautoberfläche kommen. Vermeiden Sie tiefe Schnitte, die ausbluten.
Die Anzahl der Auf- und Ab-Stichbewegungen auf der Hautoberfläche wird operabel bestimmt, wenn die Feuchtigkeit aus der DNA in PBS (10 μL) auf der Haut verschwindet. Wir haben uns 100 Mal in 30 s entschieden, weil es die konsistentesten Ergebnisse von Genen lieferte, die durch die Akufektion verabreicht wurden. Gegebenenfalls können die Nadeln für bis zu 6 Zielhautstiche (je 1 cm x 1 cm) wiederverwendet werden. Spülen Sie die Nadeln zwischen der Akufektion mit 70% Ethanol und PBS. Wechseln Sie zu neuen Nadeln, wenn diese stumpf sind, oder für andere Plasmid-DNA, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
- Legen Sie akufectierte Mäuse auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur bis zum Aufwachen zu halten.
- Bringen Sie Mäuse in ihren Käfig zurück, wenn sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt haben. Anmerkung: Halten Sie akufierte Mäuse in einem separaten Käfig (weniger als 5 Tiere pro Käfig) vom Käfig nicht akufierter Mäuse.
- Setzen Sie die Wasserflasche ein und stellen Sie den Käfig wieder in das IVC-Gestell (individuell belüfteter Käfig).
>2. Postoperative Pflege
- Überwachen Sie die Mäuse in den ersten 48 Stunden nach dem Eingriff engmaschig auf Beschwerden, einschließlich Verhaltensänderungen (Unruhe, Unruhe oder Essstörung) oder abnormales Aussehen (raues Haarkleid oder gebeugte Haltung).
