Ein in vitro Assay zur Bewertung der Anti-Tumor-Aktivität von tumorspezifischen CAR-T-Zellen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Kueberuwa, G., et al. Ein syngenes Maus-B-Zell-Lymphommodell für die präklinische Bewertung von CD19 CAR-T-Zellen. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Validierung der T-Zellaktivität von chimären Antigenrezeptoren (CAR). B-Zell-Lymphomzellen, die das CD19-Antigen und die zytoplasmatische Luciferase exprimieren, werden mit CD19-spezifischen CAR-T-Zellen kokultiviert. Die Bindung von CAR an CD19 auf einem Tumor veranlasst die CAR-T-Zellen, Zytokine und Toxine freizusetzen, die eine Zytotoxizität der Tumorzellen verursachen. Die Aktivität der CAR-T-Zellen wird durch Quantifizierung des freigesetzten Zytokins und der verminderten Luciferase-vermittelten Biolumineszenz in den Tumorzellen bewertet.

Protokoll

>1. In vitro Validierung der Aktivität von CAR-T-Zellen

Syngene Ziel-CD19+-Tumorzellen mit oder ohne Luciferase-Expression bei einer Dichte von 1 x 10 x⁴ Zellen in 100 μl vollständigem T-Zellmedium (TCM)/Well in einer 96-Well-U-Boden-Gewebekulturplatte aussäen.
Fügen Sie 1 x 10⁴ CD19 CAR-T-Zellen/Vertiefung in einem Volumen von 100 μl/Vertiefung hinzu, um ein Effektor-Ziel-Verhältnis (E:T) von 1:1,
zu erreichen Anmerkung: E:T-Verhältnisse sollten für jedes CAR-Konstrukt und jede Zielzelllinie festgelegt werden.
Verwenden Sie T-Zellen allein und Tumorzellen allein als Negativkontrollen und T-Zellen, die durch Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) (50 ng/ml) und Ionomycin (1 μg/ml) stimuliert wurden, als Positivkontrolle für die Freisetzung von Interferon-gamma (IFNγ). Co-Kultur der Zellen bei 37 °C, 5% CO₂ für 16-24 h.
Nach der Co-Kultur zentrifugieren Sie die Platten 5 Minuten lang bei 500 x g und sammeln den Überstand für die weitere IFNγ- und IL-12p70-ELISA-Analyse.
Anmerkung: Dieser kann bei -80 °C gelagert werden.
Resuspendieren Sie Zellpellets in 100 μl PBS, das Luciferin enthält (Endkonzentration von 1,5 mg/ml). Die Platten 10 min bei 37 °C inkubieren. Messen Sie dann die Lumineszenz aus jeder Vertiefung mit einem geeigneten Luminometer.
Anmerkung: Die Belichtungszeiten müssen für Zelllinien und Dichte optimiert werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1a dargestellt. Die Ex-vivo-Zytotoxizität von CAR-T-Zellen kann durch Co-Kultur mit Zelllinien, die das Zielantigen exprimieren, so modifiziert werden, dass Luciferin exprimiert wird. Da CAR-T-Zellen Zielzellen abtöten, wird Luciferin freigesetzt, daher korreliert eine Verringerung des Luminometriesignals mit der Zelltötung. Nicht transduzierte Zellen können sich oft auf die Lebensfähigkeit der Zielzellen auswirken, insbesondere über lange Inkubationszeiten. Die Konzentration von murinem IFNγ und IL-12p70 im Überstand gemäß den ELISA-Protokollen des Herstellers ist zu messen. Repräsentative Ergebnisse sind in (Abbildung 1b und 1c) dargestellt. Die Ex-vivo-Aktivierung von CAR-T-Zellen durch Co-Kultur mit Zelllinien, die das Zielantigen exprimieren, kann durch Analyse der Überstandsinhalte mittels ELISA getestet werden. Das Verhältnis von CAR-T-Zellen zu Zielzellen und die Länge der Co-Kultur-Periode müssen für jedes CAR-Konstrukt, jede Zielzelllinie und jeden Analyten optimiert werden. Die Behandlung mit PMA und Ionomycin kann als Positivkontrolle verwendet werden, um die Qualität der T-Zellen und ihre Fähigkeit zu reagieren zu bestätigen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

figure-results-1
Abbildung 1. Validierung der Aktivität von CAR-T-Zellen. αmCD19 CAR-T-Zellen wurden 16 h lang in einer 96-Well-Platte mit A20-Lymphomzellen cokultiviert, die so modifiziert wurden, dass sie Luciferase (1 x 10,⁴:1 x 10,⁴) exprimieren. Nach der Co-Kultur wurden die Zellen pelletiert und der Überstand gesammelt. A) Die Zellen wurden in PBS resuspendiert und die ...