Ein In-vitro-Assay zur Bewertung der Zytotoxizität natürlicher Killerzellen gegen Krebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Baik, C. H., et al. Ein plattenbasierter Zytotoxizitätstest zur Beurteilung der zytolytischen Funktion natürlicher Killerzellen der Plazenta von Ratten. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Durchführung eines Laktat-Dehydrogenase-Freisetzungsassays, um die Zytotoxizität von natürlichen Killerzellen (NK) gegenüber den Zielkrebszellen zu bestimmen. Der Assay quantifiziert die Freisetzung des zytoplasmatischen Laktatdehydrogenase-Enzyms aus Krebszellen, indem er die Absorption des gebildeten rot gefärbten Produkts misst.

Protokoll

>1. Zytotoxizitäts-Assay: Assay-Protokoll

1. Verwenden Sie eine kulturbehandelte 96-Well-Platte mit rundem Boden, um die Platte wie in Tabelle 1 vorgeschlagen einzurichten. Diese Tabelle zeigt die experimentellen Steuerelemente und 3 Sätze von experimentellen NK-Spalten. Dies kann auf insgesamt 10 NK-Experimentalsäulen in einer 96-Well-Platte erweitert werden.
2. Die Assay-Platte wird 4 Minuten lang bei 250 x g zentrifugiert, um sicherzustellen, dass der Effektor und die Zielzellen in Kontakt stehen. Die 96-Well-Platte wird 5 Stunden lang in einem befeuchteten Kammerinkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert, um einen ausreichenden Kontakt zwischen Ziel- und Effektorzellen und eine Zielzelllyse durch Effektorzellen zu erreichen.
   Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
3. Geben Sie 45 Minuten vor der Ernte der Überstände 10 μl 10x Lyselösung in die Vertiefungen der Zielzelle mit maximaler LDH-Freisetzung (Vertiefungen 1E, 1F, 1G und 1H) und setzen Sie die Platte wieder in die befeuchtete Kammer ein.
4. Nachdem die Inkubationszeit abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Platte 4 Minuten lang bei 250 x g. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 μl Aliquots aus allen Wells auf eine frische 96-Well-Assay-Platte mit flachem Boden.
   Anmerkung: Berühren Sie nicht den Boden der Vertiefungen, damit die Zellen nicht in die frische Assay-Platte übertragen werden. Verwenden Sie keine kultivierte, behandelte Platte als frische Assay-Platte.

>2. Assay-Reagenz herstellen.

1. Nachdem der Assay-Puffer Raumtemperatur erreicht hat, geben Sie 12 ml Assay-Puffer in eine Substrat-Mix-Flasche. Wenden und vorsichtig schütteln, bis es sich vollständig aufgelöst hat. 1 Flasche reicht für zwei 96-Well-Platten.
   Anmerkung: Der Assay-Puffer sollte während des Auftauens vor Licht geschützt werden. Unmittelbar vor Gebrauch mischen.
2. Geben Sie 50 μl Assay-Reagenz in alle Vertiefungen in der Assay-Platte aus Schritt 4.6. Decken Sie die Platte zum Schutz vor Licht mit Folie ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   Anmerkung: Neu hergestelltes Assay-Reagenz sollte in einem Gefrierschrank gelagert werden. Das Reagenz ist ca. 8 Wochen haltbar.
3. Geben Sie 50 μl Stopplösung in jede Vertiefung. Lesen Sie die Platte innerhalb von 1 Stunde nach Zugabe der Stopplösung ab und zeichnen Sie die Extinktion bei 490 nm auf.
   Repräsentative Daten sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 1: Layout der Assay-Platte. TCS = Spontane LDH-Freisetzung der Zielzelle (50 μl Zielzellen + 50 μl Zielzellmedium); TCM = Maximale LDH-Freisetzung der Zielzelle (50 μl Zielzellen + 50 μl Zielzellmedium); VCC = Volumenkorrektursteuerung (50 μl Zielzellmedium + 50 μl NK Zellmedium); CMB = Hintergrundkontrolle des Kulturmediums (50 μl Zielzellmedium + 50 μl NK Zellmedium); ECSR = Effektorzelle Spontane Freisetzung (50 μL NK-Zellen + 50 μL NK-Zellen Medium); EW = Experimentiervertiefungen (50 μL Zielzellen + 50 μL NK-Zellen).

1	arabische Ziffer	3	4	5
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3

Tabelle 2: Rohe Absorptionsdaten einer Assay-Platte, die die experimentellen Kontrollen in den Spalten 1 und 2 enthält, und experimentelle Vertiefungen zur Messung der Zytotoxizität von plazentaren NK-Zellen von NP- und RUPP-Ratten gegenüber YAC1-Zielzellen.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

1	arabische Ziffer	3	4	5
		Np	RUPP	Np
0,615	0,484	0,473	0,463	0,471
0,586	0,484	0,458	0,474	0,469
0,61	0,486	0,464	0,459	0,469
0,605	0,55	0,524	0,526	0,543
0,576	0,504	0,519	0,502 0,528	00.528
0,565	0,512	0,515	0,513	0,531
0,563	0,581	0,526	0,508	0,519

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96-Well-Gewebekulturplatte	CELLTREAT	Artikel-Nr.: 229190	Steriler, runder Boden
Abstreifer für Zellen	Fischer	8100241
Cytotox 96 Assay-Kit für nicht-radioaktive Zytotoxizität	Promega	Nr. G1780
RPMI	Gibco	11875135	1640 Mittel
YAC-1-Zelle	ATCC	TIB-160