>1. Synthese von Polycaprolactontriacrylat (PCLTA)
- 3,2 ml 400 Da Polycaprolacton (PCL)-triol über Nacht bei 50 °C in einem offenen 200-ml-Rundkolben und Kaliumcarbonat (K2CO3) in einem Glasfläschchen bei 90 °C trocknen.
- Mischen Sie das Triol mit 6,4 mL Dichlormethan (DCM) und 4,246 g K2CO3 unter Argon.
- 2,72 ml Acryloylchlorid werden in 27,2 ml DCM gemischt und über einen Zeitraum von 5 min tropfenweise zu dem Reaktionsgemisch im Kolben gegeben.
- Das Reaktionsgemisch mit Alufolie abdecken und 24 h ungestört bei Raumtemperatur unter Argon stehen lassen.
- Nach 24 h wird das Reaktionsgemisch mit einem Filterpapier auf einem Buchner-Trichter unter Vakuum filtriert, um überschüssige Reagenzien zu entsorgen.
- Fällt das Filtrat aus Schritt 1.5, das das endcapped Polymer in Diethylether in einem Verhältnis von 1:3 (vol/vol) enthält, aus und rotavap bei 30 °C, um den Diethylether zu entfernen.
2. Bildung der Polyblase
HINWEIS: Das Einspritzen von Polymer in das deionisierte (DI) Wasser würde dazu führen, dass die Polyblasen zum Boden des Fläschchens wandern, was zu einem abgeflachten Boden führt. Verwenden Sie stattdessen 10 % (wt/vol) Carboxymethylcellulose (CMC), um das Glasfläschchen zu füllen, um eine Abflachung der Polyblase zu vermeiden.
- Bereiten Sie 10%ige (wt/vol) CMC-Lösung in DI-Wasser vor.
- Füllen Sie ein 0,92-ml-Glasfläschchen mit 0,8 ml 10 % CMC mit einer 1-ml-Transferpipette.
- Mischen Sie 1000 mg/ml 14 kDa PCL in DCM und synthetisieren Sie PCLTA in einem 1:3 (vol/vol) für ein Gesamtvolumen von 200 μl oder bereiten Sie 200 μl 1000 mg/ml 5 kDa Poly(milchsäure-co-glykolsäure) diacrylat (PLGADA) in Chloroform vor.
- Mischen Sie das 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon (Photoinitiator) mit dem Polymergemisch (PLGADA oder PCL/PCLTA) in 0,005:1 (vol/vol).
- Laden Sie 200 μl Polymermischung in eine 1-ml-Glasspritze, die auf einer Spritzenpumpe montiert ist, die mit einem Dosierschlauch aus Edelstahl mit einem Innendurchmesser von 0,016 Zoll verbunden ist.
- Verwenden Sie einen Mikromotor, um die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Polymerrohrs zu steuern, um Polymer in das 10%ige CMC im Glasfläschchen zu injizieren und die Polyblase zu bilden.
- Die Polybläschen werden unter ultraviolettem (UV) Licht bei 254 nm Wellenlänge für 60 s bei 2 W/cm2 ausgehärtet.
- Die Polyblasen werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und über Nacht bei 0,010 mBar Vakuum und -85 °C lyophilisiert.
- Trennen Sie die Polyblasen mit einer Pinzette von den getrockneten CMC und waschen Sie die Polyblasen mit DI-Wasser, um CMC-Reste zu entfernen. Es ist zu beachten, dass andere Polymere verwendet werden können, wahrscheinlich mit Modifikationen, um die Freisetzungskinetik zu verändern.
>3. Modulation des Polyblasendurchmessers
- Füllen Sie ein 0,92-ml-Glasfläschchen mit 10 % CMC mit einer 1-ml-Transferpipette.
- Mischen Sie PCL/PCLTA in einem 1:3 (vol/vol) mit 1000 mg/mL 14kDa PCL und synthetisieren Sie PCLTA. Mischen Sie den Photoinitiator mit einer Polymermischung in einem Verhältnis von 0,005:1 (vol/vol).
- Laden Sie die Polymermischung in eine 1-ml-Glasspritze, die auf einer Spritzenpumpe montiert ist, die mit einem Dosierschlauch aus Edelstahl mit einem Innendurchmesser von 0,016 Zoll verbunden ist.
- Verwenden Sie einen Mikromotor, um die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Polymerrohrs zu steuern, um Polymer in das 10%ige CMC im Glasfläschchen zu injizieren und die Polyblase zu bilden.
- Um Polyblasen mit verschiedenen Durchmessern zu erhalten, variieren Sie die Dosierrate von 0,0005 bis 1 μL/s.
- Machen Sie Bilder des Fläschchens mit den Polyblasen mit unterschiedlichem Durchmesser.
- Verwenden Sie ImageJ, um den Durchmesser der Polyblasen zu quantifizieren, und verwenden Sie die Größe des Fläschchens als Maßstab.
>4. Zentrieren der Ladung innerhalb der Polyblase
- Modulation der PCL/PCLTA-Viskosität mit K2CO3:
Anmerkung: Die Viskosität von PLGADA muss mit K2CO3 nicht modifiziert werden, da die Viskosität von 5 kDa PLAGDA bei 1000 mg/mL für die Zentrierung der Ladung ausreicht.
- Fügen Sie dem PCLTAK 2CO3 (das nach der PCLTA-Reaktion isoliert wurde) in unterschiedlichen Konzentrationen hinzu, einschließlich 0 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml und 60 mg/ml.
- Messen Sie die dynamischen Viskositäten der Lösungen, indem Sie die Scherrate mit Hilfe der Rheometrie von 0 auf 1000 1/s ändern.
- Die Ladung wird von Hand in die Mitte der Polybläschen injiziert (siehe Schritt 4.2 zur Herstellung des Ladungsgemisches), die mit den PCL/PCLTA-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von K2CO3 gebildet wurden (Schritt 4.1.1). Bestimmen Sie die optimale Konzentration von K2CO3, indem Sie beobachten, welche Lösung aus Schritt 4.1.1 dazu führen kann, dass die Ladung in der Mitte zurückgehalten wird.
- Zentrierung der Fracht (bereits gezeigte Machbarkeit mit kleinen Molekülen) mit CMC
- Mischen Sie die Ladung über Nacht mit 5 % (Gew./Vol.) CMC in einem Rotator, um die Viskosität der Ladung zu erhöhen.
- Injizieren Sie manuell 2 μl Cargo-Gemisch in die Polyblase und fahren Sie mit der UV-Härtung bei 254 nm Wellenlänge für 60 s bei 2 W/cm2 fort.
- Die Polybläschen werden 30 s lang in flüssigem Stickstoff schockgefroren und über Nacht bei 0,010 mBar Vakuum und -85 °C lyophilisiert.
- Trennen Sie die Polyblasen mit einer Pinzette von der getrockneten CMC und waschen Sie sie mit DI-Wasser, um CMC-Reste zu entfernen.
- Schneiden Sie die Polyblase in zwei Hälften und bilden Sie die Hälften mit konfokaler Mikroskopie ab, um sicherzustellen, dass die Ladung zentriert ist (siehe Schritt 6 für die verwendeten Anregungs- und Emissionswellenlängen).
>5. Formulierung der Ladung
HINWEIS: Die Polybubble-Formulierung kann verschiedene Frachttypen aufnehmen, einschließlich kleiner Moleküle, Proteine und Nukleinsäuren.
- Basierend auf früheren Studien sollten im Falle von Proteinfracht Hilfsstoffe wie Polyethylenglykol (PEG), Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Glykopolymere verwendet werden, um die Stabilität des Proteins während der Polyblasenformulierung zu verbessern.
- Bilden Sie Polyblasen basierend auf dem Protokoll in Schritt 2.
- Bereiten Sie die Antigenlösung vor, indem Sie 17,11 g Trehalose zu 625 μl HIV gp120/41 Antigen hinzufügen.
- Injizieren Sie manuell 1 μl Antigenlösung in die Mitte der Polyblase.
- Öffnen Sie Polyblasen an den Tagen 0, 7, 14 und 21 und zeichnen Sie die Fluoreszenz des Antigens mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 497 nm bzw. 520 nm auf.
- Bestimmen Sie die Funktionalität des Antigens mit dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und verwenden Sie 5 % fettfreie Milch als Blockierungspuffer.
>6. Freigabe von Fracht
HINWEIS: Kleines Molekül oder Antigen kann als Frachttyp verwendet werden
- Kleines Molekül
- Polybläschen mit zentriertem Acriflavin in 400 μl Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) bei 37 °C, 50 °C für PLGADA-Polybläschen und bei 37 °C, 50 °C, 70 °C für PCL/PCLTA-Polybläschen inkubieren.
Anmerkung: Der Grund, warum wir empfehlen, über Körpertemperaturen zu testen, besteht darin, a) die Temperatur (50 °C) zu simulieren, bei der die Polyblase beim Lasern der Gold-Nanostäbchen (AuNRs) innerhalb von PCL und PLGA liegt; und b) den Abbauprozess von PCL beschleunigen (50 °C, 70 °C).
- Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt die Überstände und ersetzen Sie sie durch 400 μl frisches PBS.
- Verwenden Sie ein Platten-Reader, um die Fluoreszenzintensitäten in den gesammelten Überständen zu quantifizieren.
Anmerkung: Für Acriflavin ist ex/em von 416 nm/514 nm zu verwenden.
- Antigen
- Polyblasen mit zentriertem Rinderalbuminserum (BSA)-488 in 400 μl PBS bei 37 °C, 50 °C für PLGADA-Polyblasen und bei 37 °C, 50 °C für PCL/PCLTA-Polyblasen inkubieren.
- Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt die Überstände und ersetzen Sie sie durch 400 μl frisches PBS.
- Verwenden Sie einen Platten-Reader, um die Fluoreszenzintensitäten in den gesammelten Überständen zu quantifizieren. Verwendung von ex/em von 497 nm/520 nm für BSA-488.
Anmerkung: Eine Freisetzungsstudie bei 70 °C für PCL/PCLTA-Polyblasen sollte nicht durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass das Antigen extremen Temperaturen ausgesetzt wird.