>1. Bakterielle Zellkulturen und Herstellung von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS)
HINWEIS: Die Schritte 1.2 – 1.9 werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt.
- Bereiten Sie eine De Man-Rogosa-Sharpe (MRS)-Agarplatte und eine Brühe mit L-Cystein vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren.
- Die MRS-Agarplatte wird in der anaeroben Kammer H2 bei 37 °C mit 20 ppm Sauerstoff vorinkubiert.
- Tauen Sie den Lactobacillus-Bakterienbestand auf und beimpfen Sie die Agarplatte mit der Bakterienkultur (Abbildung 1A (i)).
- Inkubieren Sie die Bakterien 2 - 3 Tage lang in der anaeroben Kammer H2 bei 37 °C und 20 ppm Sauerstoff, bis einzelne Bakterienkolonien erhalten werden.
- Waschen und trocknen Sie das anerobe Kulturröhrchen vom Typ Hungate. Autoklavieren Sie das Kulturröhrchen bei 121 °C für 15 min.
- Dann wird das Röhrchen in der anaeroben Kammer H2 bei 37 °C und 20 ppm Sauerstoff inkubiert, um Sauerstoff zu entfernen.
- Geben Sie 2 - 3 mL MRS-Brühe in das Röhrchen. Verschließen Sie das Rohr mit einem Butylkautschukstopfen und schrauben Sie die Kappe fest.
- Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie mit einer Schlaufe und legen Sie sie in das 1,5 mL Kulturröhrchen mit 500 μl 1x PBS. (Abbildung 1A (ii)).
- Suspendieren Sie die Kolonie mit einer 1-ml-Spritze (Abbildung 1A (iii)). Führen Sie dazu die Nadel der 1-ml-Spritze in die Mitte des Röhrchendeckels ein, saugen Sie die suspendierte Kolonie ab und resuspendieren Sie sie dann wieder in das MRS-Brühemedium. (Abbildung 1A (iv)).
- Inkubieren Sie das MRS-Bouillonmedium 2 Tage lang in einem Schüttel-Inkubator (37 °C, 5 % CO2, 200 U/min).
- Messen Sie die optische Dichte (OD) mit einem Spektralphotometer, um die Bakterienwachstumskurven zu überwachen, bis die Extinktion bei OD620 2,0 erreicht.
- Trennen Sie die Bakterienpellets und das konditionierte Medium durch Zentrifugieren bei 1.000 x g für 15 min. Waschen Sie die gesammelten Bakterienpellets mit 1x PBS und resuspendieren Sie sie in 4 mL RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum. Geben Sie keine Antibiotika in das Medium.
- Bewahren Sie die Bakterienpellets in RPMI auf und inkubieren Sie sie in einem Schüttel-Inkubator für 4 h bei 37 °C mit 5 % CO2 bei einer Drehzahl von 100 U/min.
- Für die Herstellung des probiotischen Überstands wird das Bakterienpellet durch Zentrifugation bei 1000 x g und 15 min bei 4 °C entfernt. Der zurückgewonnene Überstand wird mit einem 0,22-μm-Filter sterilfiltriert und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
>2. Erzeugung von Sphäroiden
- Aufbereitung von Darmkrebszelllinien
- Züchten Sie DLD-1-, HT-29- und WiDr-Zelllinien als Monoschichten bis zu einer Konfluenz von 70-80 % und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator (Wachstumsmedium: RPMI enthält 10 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin).
- Bei Zellen, die in einer 100 mm Petrischale gezüchtet wurden, waschen Sie die Platte zweimal mit 4 mL 1x PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie die Petrischale 2 Minuten lang bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator, um die Zellen zu dissoziieren.
- Überprüfen Sie nach der Inkubation die Zelldissoziation unter einem Mikroskop und neutralisieren Sie Trypsin-EDTA mit 5 ml Wachstumsmedium.
- Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und 3 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert.
- Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn vorsichtig mit 3 ml Wachstumsmedium.
- Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau, um lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer zu bestimmen. (Abbildung 1B (i))
- Bildung von Sphäroiden
- In einem konischen 15-ml-Röhrchen werden die Zellen von 2.1,5 verdünnt, um 1 - 2 x 105 Zellen/ml zu erhalten (Abbildung 1B (ii))
- Geben Sie die Endkonzentration von 0,6 % Methylcellulose in die Zellsuspension und überführen Sie die verdünnten Zellen in ein steriles Reservoir.
HINWEIS: Für jede Zelllinie sollte die benötigte Menge an Methylcellulose titriert und entsprechend bestimmt werden.
- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 μl Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikroplatte mit rundem Boden mit extrem geringer Bindung zu dispensieren. (Abbildung 1B (iii))
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator für 24 - 36 h.
- Nach 24 - 36 h beobachten Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die Sphäroidbildung sicherzustellen.
>3. Behandlung von 3D-Darmkrebszellen mit LCFS
- Generieren Sie Sphäroide, wie in den Schritten 2 und 3 beschrieben.
- Tauen Sie das gefrorene LCFS vor der LCFS-Behandlung 10 - 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf.
- Impfen Sie die LCFS-Stammlösung in ein Wachstumsmedium. Seriell auf 25 %, 12,5 % und 6 % im Wachstumsmedium verdünnen (d. h. 25 % LCFS = 150 μl Wachstumsmedium + 50 μl LCFS).
- Nehmen Sie die Zellkulturplatte mit den Sphäroiden aus dem Inkubator und entfernen Sie mit einer 200-μl-Pipette so viel wie möglich aus dem Wachstumsmedium aus jeder Vertiefung.
- Geben Sie das Wachstumsmedium mit LCFS auf die Zellen und inkubieren Sie bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator für 24 - 48 h.
Anmerkung: Das zu verwendende Volumen hängt von der Plattengröße wie folgt ab: 2 mL für 6-Well-Zellkulturplatten; 200 μl für 96-Well-Zellkulturplatten.
