Entwicklung eines humanisierten Mausmodells mit menschlichen Leberzellen und Immunzellen

Abstract

Quelle: Dagur, R. S. et al., Etablierung des dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells für die HIV-assoziierte Leberpathogenese.J. Vis. Exp.(2019)

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Generierung eines dualen humanisierten Mausmodells mit einem menschlichen Immunsystem und Leberzellen. Dabei werden menschliche Leberzellen und hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen durch intrasplenische Injektion in eine transgene immundefiziente Maus transplantiert, was zur Transplantation von Leberzellen und zur Entwicklung menschlicher Immunzellen führt.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Verarbeitung von Nabelschnurblut und Isolierung von humanen hämatopoetischen Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs)

1. Führen Sie alle Schritte des Protokolls unter sterilen Bedingungen in Laminar-Flow-Werkbänken durch.
2. Nehmen Sie Nabelschnurblut (CB), das in heparinisierten Röhrchen gesammelt wurde, und erhöhen Sie das Volumen durch Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf bis zu 35 ml. Die Probe wird auf das Lymphozyten-Trennmedium (LSM) gelegt, wie in Abbildung 1 dargestellt, und das LSM mit dem geschichteten CB bei 400 x g für 35 min bei 4 °C ohne Bremsen zentrifugiert.
   Anmerkung: Verdünnen Sie das Blut vorsichtig und vorsichtig, um eine Vermischung an der Grenzfläche zu vermeiden.
3. Entfernen Sie vorsichtig das obere LSM und die Plasmaschicht und übertragen Sie die weiße Buffy-Coat-Grenzfläche mit einer Transferpipette in ein neues Röhrchen.
4. Resuspendieren Sie das Buffy Coat in 30 - 40 mL eiskaltem Puffer (PBS + 0,5 % Rinderserumalbumin [BSA] + 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]). Kombinieren Sie mit einer Pipette 20 μl der Zellsuspension mit 20 μl 0,4 % Trypanblau und pipettieren Sie 10 μl der Mischung in die äußere Öffnung einer der beiden Kammern eines Zählobjektträgers und führen Sie den Objektträger in einen automatisierten Zellzähler ein, um die Zellen zu zählen.
   Anmerkung: Verwenden Sie in allen Schritten eiskalten Puffer, da dies dazu beiträgt, die Zellen lebensfähig zu halten.
5. Die Zellen werden bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgesaugt. Fügen Sie dann 300 μl eiskalten Puffer hinzu.
6. Fügen Sie 100 μl humanes Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz und 100 μl monoklonale Maus-Anti-Human-CD34-Antikörper-konjugierte Mikrokügelchen für bis zu 1 x 10⁸ Zellen hinzu (siehe Materialtabelle). 30 min bei 4 °C inkubieren, 10 mL eiskalten Puffer zum Waschen der Zellen hinzufügen und 10 min bei 4 °C bei 300 x g zentrifugieren.
   HINWEIS: Skalieren Sie dies entsprechend der Zellennummer hoch, wenn mehr als 1 x 10⁸ Zellen vorhanden sind.
7. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Puffer und fahren Sie mit dem magnetischen Trennschritt fort, um HSPCs anzureichern.
8. Legen Sie eine LS-Säule mit positiver Selektion (siehe Materialtabelle) in das magnetisch aktivierte Zellsortierfeld und führen Sie sie mit 3 mL Puffer durch.
9. Laden Sie die Probe in die LS-Säule, die Mikrokügelchen, die an humanes CD34+ gebunden sind, in Proben einfangen und unter dem Einfluss der Schwerkraft in das Sammelröhrchen fließen lassen kann.
10. Waschen Sie die Säule 3x mit Puffer und sammeln Sie das Elue im selben Sammelröhrchen wie die ^{CD34-Fraktion} der Zellen.
11. Tauchen Sie die Säule mit 5 mL Puffer ein, um die CD34⁺-Zellen in ein neues Sammelröhrchen zu eluieren. Wiederholen Sie den Vorgang, um eine Reinheit von >90 % zu erreichen.
12. Zählen Sie die eluierten CD34⁺-Zellen mit dem Trypanblau-Farbstoff in einem Hämozytometer. Nach der Zählung zentrifugieren Sie die CD34⁺-Zellen bei 300 x g für 5 min und verwerfen Sie den Überstand.
13. Resuspendieren Sie die CD34⁺-Zellen in 25 μl PBS für eine Injektion, die sofort bei der Transplantation verwendet werden kann, oder kryokonservieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1-2 Millionen/ml in Gefriermedium (Roswell Park Memorial Institute Medium [RPMI 1640 Medium] + 50 % fötales Rinderserum (FBS) + 10 % Dimethylsulfoxid [DMSO]) zur weiteren Verwendung bei der Transplantation.
    Anmerkung: Zählen Sie lebensfähige Zellen immer neu, bevor Sie sie für eine Transplantation verwenden.
14. Um die Reinheit des CD34⁺-Elus zu überprüfen, nehmen Sie 50 μl der Suspension und inkubieren Sie sie mit 10 μl Phycoerythrin oder PE-konjugiertem anti-humanem CD34-Antikörper für 30 min bei 4 °C. Waschen Sie nach der Antikörperinkubation die gefärbten Zellen mit PBS, resuspendieren Sie sie in 100 μl PBS und fahren Sie dann mit der Durchflusszytometrie fort. Fügen Sie ein zusätzliches Röhrchen mit Zellen ohne Antikörper hinzu, um das Gate im Durchflusszytometer zu gestalten.
15. Analysieren Sie die Daten nach der Erfassung, indem Sie den interessierenden Bereich in einem Diagramm mit Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) auswählen, gefolgt von einem Gating für einzelne Zellen in Diagrammen mit FSC-Fläche und FSC-Höhe. Gate CD34-positive Zellen auf einzelnen Zellen im PE-Kanal und SSC-Area-Plot.

>2. Vorbereitung von humanen Hepatozyten (HEPs) für die Transplantation

1. Entfernen Sie die kryokonservierten Hepatozyten aus dem flüssigen Stickstoff, tauchen Sie das Fläschchen schnell in das Wasserbad und tauen Sie es ca. 90 - 120 s auf.
2. Entfernen Sie die Kappe der Durchstechflasche und gießen Sie die aufgetauten Hepatozyten in das konische 50-ml-Röhrchen des erwärmten Auftaumediums.
3. Hängen Sie die Zellen auf, indem Sie das 50-ml-Röhrchen einige Sekunden lang von Hand bewegen.
   Anmerkung: Verwirbeln Sie das Rohr nicht.
4. Pelletieren Sie die Zellen bei 100 x g für 8 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die pelletierten Zellen in PBS mit 0,1 % BSA und poolen Sie sie entweder mit frischen oder aufgetauten HSPCs (Verhältnis 10:1) in PBS in einem Endvolumen von 80 μl/Maus.

>3. Umgang mit Tieren, Screening, Genotypisierung und Behandlung für die Transplantation von humanem HSPC und Hepatozyten

1. Umgang mit Tieren
   1. Infolge einer schweren Immunschwäche züchten, unterbringen und behandeln Sie TK-NOG-Mäuse unter aseptischen Bedingungen.
   2. Tragen Sie immer einen Laborkittel, Handschuhe, Schuhüberzieher und eine Gesichtsmaske, um eine Infektion mit potenziell pathogenen Mikroorganismen zu vermeiden.
   3. Verwenden Sie sterile Handschuhe und Instrumente für die Operation und behandeln Sie die Tiere während der gesamten Operation aseptisch.
2. Auswahl von TK-NOG-Mäusen für das Experiment
   1. Erhaltung der TK-NOG-Stammkolonie durch Zucht weiblicher TK-NOG-Mäuse mit männlichen Nicht-TK-NOG-Wurfgeschwistern und Selektion transgener Nachkommen durch Genotypisierung.
      Anmerkung: Es ist eine Genotypisierung durchzuführen (siehe Schritt 3.3), um das Vorhandensein oder Fehlen des Transgens bei neugeborenen männlichen und weiblichen Mäusen zum Zeitpunkt der Entwöhnung zu bestimmen.
   2. Wählen Sie Männer im Alter von 6 bis 8 Wochen für die Transplantation aus, da sie sehr empfindlich auf die GCV-vermittelte Depletion von HSV-TK-Transgen-exprimierenden Hepatozyten reagieren.
   3. Versehen Sie die Mäuse zum Zeitpunkt der Entwöhnung oder Operation mit Ohrmarken, um die Identifizierung zu erleichtern. Notieren Sie sich das Gewicht und den Gesundheitszustand der Tiere.
3. Genotypisierung des Vorhandenseins des HSV-TK-Transgens mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
   1. Führen Sie die Genotypisierung zum Zeitpunkt der Entwöhnung durch (in der Regel im Alter von 3 - 4 Wochen). Für die Genotypisierung schneiden Sie ein Stück des Mausohrs in eine biologische Sicherheitswerkbank mit laminarer Strömung, um die Sterilität zu erhalten, und extrahieren Sie genomische DNA mit einem genomischen DNA-Isolationskit.
   2. Amplifizieren Sie genomische DNA, die aus dem Ohrstück extrahiert wurde, in einem 20-μl-Reaktionsgemisch zum Screening auf HSV-TK-Transgen unter Kontrolle des humanen Albumin-Promotors durch Zugabe von 1 μl Forward Primer 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL Reverse Primer 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL FAM-Sonde 5'-FAM-AATCGCCCCGGCTGC-MGB-3', und 10 μl Mastermix auf einem Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsinstrument (PCR).
   3. Stellen Sie die Real-Time-PCR-Einstellungen wie folgt ein: 60 °C für 30 s (Preread-Stufe), 95 °C für 10 min (Hold-Phase), 40 Zyklen à 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 min (PCR-Stufe) und 60 °C für 30 s (Postread-Stufe).
      Anmerkung: Ein Zyklus der Schwelle (Ct) unter 22 wird als positiv für das HSV-TK-Transgen angesehen.
4. Behandlung mit Ganciclovir und Treosulfan
   1. Injizieren Sie den TK-NOG-Mäusen mit einer 27-g-Nadel 2x täglich an Tag 7 und an Tag 5 intraperitoneale GCV-Injektionen (6 mg/kg) in 100 μl Kochsalzlösung, bevor Sie operiert werden, um die transgenen Parenchymzellen der Mäuse zu depletieren (wie in der experimentellen Strategie in Abbildung 2 gezeigt).
   2. An den Tagen 3, 2 und 1 vor der Operation wurden Mäuse mit einer 27-g-Nadel mit nicht-myeloablativen intraperitonealen Dosen von Treosulfan (1,5 g/kg/Tag) in 100 μl Kochsalzlösung vorkonditioniert.
   3. Einen Tag vor der Operation entnehmen Sie zwei bis drei Tropfen (~100 μl) Blut aus der Vena submandibula, indem Sie sie mit einer 5-mm-Lanzette einstechen, und isolieren Sie das Serum, indem Sie es zentrifugieren (1.500 x g für 10 min bei 4 °C) für den Alaninaminotransferase (ALT)-Assay, um den Grad der Leberschädigung zu beurteilen.
5. Vorbereitung auf die Operation
   1. Verwenden Sie eine Haarschneidemaschine, um das Fell der Maus um die Inzisionsstelle (links von der Bauchfellwand) vor der Operation zu rasieren.
   2. Stellen Sie den Sauerstofffluss auf 1 l/min und den Isofluranfluss auf 3% - 5% in einer Induktionskammer mit einem Mausanästhesiegerät ein. Legen Sie jeweils eine Maus zur Anästhesie in die Induktionskammer.
   3. Befestigen Sie das eine Ende eines sterilen Verlängerungsschlauchs (mit einer Aufnahmekapazität von 550 μl Suspension; siehe Materialtabelle für Spezifikationen) an einer 30-g-Nadel und das andere Ende an einer 1-ml-Spritze.
   4. Füllen Sie die Spritze mit der Suspension (80 μl/Maus) aus gepoolten HEPs und HSPCs (siehe Abschnitt 2), setzen Sie die Spritze in die Kerbe einer Pipette mit wiederholter Abgabe ein und stellen Sie den Dispenser so ein, dass in jeder Presse 10 μl abgegeben werden.
   5. Sobald die Mäuse betäubt sind (in der Regel nach 3 - 4 Minuten), schalten Sie den Isofluranfluss auf den Nasenkonus um und reduzieren Sie die Isofluranflussrate auf 2% - 3%.
6. Intrasplenische Transplantation von humanen HSPCs und Hepatozyten bei Mäusen
   1. Führen Sie alle Operationsschritte in einem Laminar-Flow-Schrank unter sterilen Bedingungen durch.
   2. Legen Sie ein sauberes, steriles Tuch auf die Arbeitsfläche und schrubben Sie die linke Körperseite jeder Maus mit 10 % Povidon-Jod, gefolgt von 70 % Isopropylalkohol, bevor Sie einen Schnitt vornehmen.
   3. Machen Sie mit einer Vanna-Schere einen kleinen Schnitt (~1 - 1,5 cm lang und 5 mm tief) in die Haut, den Muskel und das Bauchfell links von der Bauchhautwand, um in die Bauchhöhle etwa 5 mm unterhalb des unteren Randes des Brustkorbs einzudringen.
   4. Lokalisieren Sie die Milz, ziehen Sie sie leicht mit einer Pinzette in den Operationsbereich, um einen einfachen Zugang zu erhalten, und führen Sie die 30-G-Nadel in den unteren Pol der Milz ein.
   5. Entriegeln Sie den Kolben der Dosierpipette und geben Sie jeweils 10 μl des Volumens ab, mit einem Limit von 60-80 μl pro Milz. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück und schneiden Sie die Milz mit Ligaturklammern mit einem Ligaturapplierer ab.
   6. Schieben Sie die Milz mit Applikatoren mit Wattespitze, die mit sterilem PBS benetzt sind, zurück in die Körperhöhle.
   7. Verschließen Sie die Muskelschicht der Bauchdecke mit einer resorbierbaren Naht, die das Nahtmuster unterbricht (nicht durchgehend). Erreichen Sie den Hautverschluss mit einem unterbrochenen Nahtmuster unter Verwendung nicht resorbierbarer Nähte.

Results

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Anreicherung von CD34⁺-Zellen aus Nabelschnurblut.(A) Nabelschnurblut wird auf das Lymphozyten-Trennmedium (LSM) geschichtet und zentrifugiert, um das Buffy Coat zu isolieren. (B) LS-Säulen werden auf einen Magnetständer gestellt und mit einem BSA-Puffer gespült, gefolgt von einer Zugabe eines Buffy-Coats. Zelle...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
27G1/2" Nadeln	BD Biowissenschaften	305109
30G1/2" Nadeln	BD Biowissenschaften	305106
5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden, 12 x 75 mm Ausführung	Corning	352054
BD 1 mL Tuberkulinspritze ohne Nadel	BD Biowissenschaften	309659
BD FACS Array-Bioanalysator	BD Biowissenschaften		Zur Reinheitsprüfung von eluierten CD34+-Zellen
BD FACS-Array-Software	BD Biowissenschaften		Software zur Analyse der erfassten CD34+-Zelle auf einem FACS-Array
BD FACS Lyselösung	BD Biowissenschaften	349202	Zur Lyse der roten Blutkörperchen
BD LSR II	BD Biowissenschaften		Instrument zur Entnahme von Durchflusszytometrie-Proben
BD Vacutainer Blutentnahmeröhrchen aus Kunststoff	BD Biowissenschaften	BD 367874	Um Nabelschnurblut zu sammeln
Rinderserumalbumin	Sigma-aldrich	Nr. A9576
CD34 MicroBead Kit, Mensch	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-046-702	Zur Isoierung von CD34+ HSPC
CD34-PE, Mensch	Miltenyi Biotec	Artikel-Nr.: 130-081-002	Antikörper zur Reinheitsprüfung von eluierten CD34+-Zellen
Folien zur Zellzählung	Bio-rad	1450015
ChargeSwitch gDNA Mini-Gewebe-Kit	Thermofisher wissenschaftlich	CS11204	Zur Extraktion genomischer DNA aus dem Ohrstück
Applikatoren mit Baumwollspitze	Mckesson	24-106-2S
DMSO (Dimethylsulfoxid)	Sigma-aldrich	D2650-5X5ML
Verlängerungsset Microbore Slide Clamp(s) Fester männlicher Luer-Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0,55 mL Fluidweg steril	BD Biowissenschaften	30914	Befestigung an der Dosierpipette und zur Beladung mit HSPC- und HEP-Absaugung
FACS Diva Version 6	BD Biowissenschaften		Durchflusszytometer-Software, die für die Aufnahme der Probe erforderlich ist
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco	10438026
FLOWJO Analysesoftware v10.2	FLOWJO, LLC		Software für die Analyse von Durchflusszytometrie
Ganciclovir	APP Pharmaceuticals, Inc.	Artikel-Nr.: 315110	Prescripition-Medikament
Greiner MiniCollect EDTA-Röhrchen	Greiner bio-one	450475
Hepatozyten Auftaumedium	Forschungslabore des Dreiecks	MCHT50
Horizon Open Ligating Clip-Applier	Teleflex	537061	So halten Sie die ligativen Clips
Humaner Hepatozyten	Forschungslabore des Dreiecks	HUCP1	Kryokonservierte humane Hepatozyten, induktionsqualifiziert
Irisschere, gerade	Ted Pella, Inc.	Artikel-Nr.: 13295
Lanzette	MEDIpoint	Goldrute 5 mm
LS-Säulen	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-042-401	Wird verwendet, um CD34+ Mikrokügelchen einzufangen (Positivauswahl)
Lymphozyten-Trennmedium (LSM)	MP Biomedizin	Artikel-Nr.: 50494	Zur Isoierung von Lymphozyten aus peripherem Blut
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-042-303	Hält Qudro MACS Seperator und LS Spalten
McPherson-Vannas Mikro-Präparierfederschere	Roboz Chirurgisches Instrument Co.	RS-5605	Wird verwendet, um einen Schnitt in der Haut zu machen, um die Milz freizulegen
Mikro-Präparierzange	Roboz Chirurgisches Instrument Co.	RS-5157	Zum Halten und Herausziehen der Milz aus der Bauchhöhle
Maus CD45-FITC	BD Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 553080	Mausspezifisch
PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Hyklon	SH30256.02
Qudro MACS Trennzeichen	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-090-976	fasst vier LS-Spalten
RPMI 1640 mittel	Gibco	11875093
StepOne Plus Echtzeit-PCR	Angewandte Biosysteme		Instrument zur Genotypisierung
Stepper-Serie Pipette mit wiederholter Abgabe 1 ml	DYMAX CORP	Nr. T15469	Wird verwendet, um HSPC- und HEP-Supension auf kontrollierte Weise abzugeben
TaqMan Genexpressions-Mastermix	Thermofisher wissenschaftlich	4369016
TC20 automatisierter Zellzähler	Bio-rad	1450102
TK-NOG-Mäuse			Zur Verfügung gestellt vom Zentralinstitut für Versuchstiere (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito und Hiroshi Suemizu)
Treosulfan	Medac GmbH		Zur Verfügung gestellt von Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)
Trypan-Blau	Bio-rad	1450022
Vannas-Typ Mikroschere, gerade, 80mm L	Ted Pella, Inc.	Nr. 1346	Wird verwendet, um einen Schnitt in der Haut zu machen, um die Milz freizulegen
Weck Hemoclip traditionelle Titan-Ligatur-Clips	Nähte	Artikel-Nr.: 523700	Zur Ligatur der Milz nach der Injektion