Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Verarbeitung von Nabelschnurblut und Isolierung von humanen hämatopoetischen Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs)
- Führen Sie alle Schritte des Protokolls unter sterilen Bedingungen in Laminar-Flow-Werkbänken durch.
- Nehmen Sie Nabelschnurblut (CB), das in heparinisierten Röhrchen gesammelt wurde, und erhöhen Sie das Volumen durch Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf bis zu 35 ml. Die Probe wird auf das Lymphozyten-Trennmedium (LSM) gelegt, wie in Abbildung 1 dargestellt, und das LSM mit dem geschichteten CB bei 400 x g für 35 min bei 4 °C ohne Bremsen zentrifugiert.
Anmerkung: Verdünnen Sie das Blut vorsichtig und vorsichtig, um eine Vermischung an der Grenzfläche zu vermeiden.
- Entfernen Sie vorsichtig das obere LSM und die Plasmaschicht und übertragen Sie die weiße Buffy-Coat-Grenzfläche mit einer Transferpipette in ein neues Röhrchen.
- Resuspendieren Sie das Buffy Coat in 30 - 40 mL eiskaltem Puffer (PBS + 0,5 % Rinderserumalbumin [BSA] + 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]). Kombinieren Sie mit einer Pipette 20 μl der Zellsuspension mit 20 μl 0,4 % Trypanblau und pipettieren Sie 10 μl der Mischung in die äußere Öffnung einer der beiden Kammern eines Zählobjektträgers und führen Sie den Objektträger in einen automatisierten Zellzähler ein, um die Zellen zu zählen.
Anmerkung: Verwenden Sie in allen Schritten eiskalten Puffer, da dies dazu beiträgt, die Zellen lebensfähig zu halten.
- Die Zellen werden bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgesaugt. Fügen Sie dann 300 μl eiskalten Puffer hinzu.
- Fügen Sie 100 μl humanes Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz und 100 μl monoklonale Maus-Anti-Human-CD34-Antikörper-konjugierte Mikrokügelchen für bis zu 1 x 108 Zellen hinzu (siehe Materialtabelle). 30 min bei 4 °C inkubieren, 10 mL eiskalten Puffer zum Waschen der Zellen hinzufügen und 10 min bei 4 °C bei 300 x g zentrifugieren.
HINWEIS: Skalieren Sie dies entsprechend der Zellennummer hoch, wenn mehr als 1 x 108 Zellen vorhanden sind.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Puffer und fahren Sie mit dem magnetischen Trennschritt fort, um HSPCs anzureichern.
- Legen Sie eine LS-Säule mit positiver Selektion (siehe Materialtabelle) in das magnetisch aktivierte Zellsortierfeld und führen Sie sie mit 3 mL Puffer durch.
- Laden Sie die Probe in die LS-Säule, die Mikrokügelchen, die an humanes CD34+ gebunden sind, in Proben einfangen und unter dem Einfluss der Schwerkraft in das Sammelröhrchen fließen lassen kann.
- Waschen Sie die Säule 3x mit Puffer und sammeln Sie das Elue im selben Sammelröhrchen wie die CD34-Fraktion der Zellen.
- Tauchen Sie die Säule mit 5 mL Puffer ein, um die CD34+-Zellen in ein neues Sammelröhrchen zu eluieren. Wiederholen Sie den Vorgang, um eine Reinheit von >90 % zu erreichen.
- Zählen Sie die eluierten CD34+-Zellen mit dem Trypanblau-Farbstoff in einem Hämozytometer. Nach der Zählung zentrifugieren Sie die CD34+-Zellen bei 300 x g für 5 min und verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die CD34+-Zellen in 25 μl PBS für eine Injektion, die sofort bei der Transplantation verwendet werden kann, oder kryokonservieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1-2 Millionen/ml in Gefriermedium (Roswell Park Memorial Institute Medium [RPMI 1640 Medium] + 50 % fötales Rinderserum (FBS) + 10 % Dimethylsulfoxid [DMSO]) zur weiteren Verwendung bei der Transplantation.
Anmerkung: Zählen Sie lebensfähige Zellen immer neu, bevor Sie sie für eine Transplantation verwenden.
- Um die Reinheit des CD34+-Elus zu überprüfen, nehmen Sie 50 μl der Suspension und inkubieren Sie sie mit 10 μl Phycoerythrin oder PE-konjugiertem anti-humanem CD34-Antikörper für 30 min bei 4 °C. Waschen Sie nach der Antikörperinkubation die gefärbten Zellen mit PBS, resuspendieren Sie sie in 100 μl PBS und fahren Sie dann mit der Durchflusszytometrie fort. Fügen Sie ein zusätzliches Röhrchen mit Zellen ohne Antikörper hinzu, um das Gate im Durchflusszytometer zu gestalten.
- Analysieren Sie die Daten nach der Erfassung, indem Sie den interessierenden Bereich in einem Diagramm mit Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) auswählen, gefolgt von einem Gating für einzelne Zellen in Diagrammen mit FSC-Fläche und FSC-Höhe. Gate CD34-positive Zellen auf einzelnen Zellen im PE-Kanal und SSC-Area-Plot.
>2. Vorbereitung von humanen Hepatozyten (HEPs) für die Transplantation
- Entfernen Sie die kryokonservierten Hepatozyten aus dem flüssigen Stickstoff, tauchen Sie das Fläschchen schnell in das Wasserbad und tauen Sie es ca. 90 - 120 s auf.
- Entfernen Sie die Kappe der Durchstechflasche und gießen Sie die aufgetauten Hepatozyten in das konische 50-ml-Röhrchen des erwärmten Auftaumediums.
- Hängen Sie die Zellen auf, indem Sie das 50-ml-Röhrchen einige Sekunden lang von Hand bewegen.
Anmerkung: Verwirbeln Sie das Rohr nicht.
- Pelletieren Sie die Zellen bei 100 x g für 8 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die pelletierten Zellen in PBS mit 0,1 % BSA und poolen Sie sie entweder mit frischen oder aufgetauten HSPCs (Verhältnis 10:1) in PBS in einem Endvolumen von 80 μl/Maus.
>3. Umgang mit Tieren, Screening, Genotypisierung und Behandlung für die Transplantation von humanem HSPC und Hepatozyten
- Umgang mit Tieren
- Infolge einer schweren Immunschwäche züchten, unterbringen und behandeln Sie TK-NOG-Mäuse unter aseptischen Bedingungen.
- Tragen Sie immer einen Laborkittel, Handschuhe, Schuhüberzieher und eine Gesichtsmaske, um eine Infektion mit potenziell pathogenen Mikroorganismen zu vermeiden.
- Verwenden Sie sterile Handschuhe und Instrumente für die Operation und behandeln Sie die Tiere während der gesamten Operation aseptisch.
- Auswahl von TK-NOG-Mäusen für das Experiment
- Erhaltung der TK-NOG-Stammkolonie durch Zucht weiblicher TK-NOG-Mäuse mit männlichen Nicht-TK-NOG-Wurfgeschwistern und Selektion transgener Nachkommen durch Genotypisierung.
Anmerkung: Es ist eine Genotypisierung durchzuführen (siehe Schritt 3.3), um das Vorhandensein oder Fehlen des Transgens bei neugeborenen männlichen und weiblichen Mäusen zum Zeitpunkt der Entwöhnung zu bestimmen.
- Wählen Sie Männer im Alter von 6 bis 8 Wochen für die Transplantation aus, da sie sehr empfindlich auf die GCV-vermittelte Depletion von HSV-TK-Transgen-exprimierenden Hepatozyten reagieren.
- Versehen Sie die Mäuse zum Zeitpunkt der Entwöhnung oder Operation mit Ohrmarken, um die Identifizierung zu erleichtern. Notieren Sie sich das Gewicht und den Gesundheitszustand der Tiere.
- Genotypisierung des Vorhandenseins des HSV-TK-Transgens mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
- Führen Sie die Genotypisierung zum Zeitpunkt der Entwöhnung durch (in der Regel im Alter von 3 - 4 Wochen). Für die Genotypisierung schneiden Sie ein Stück des Mausohrs in eine biologische Sicherheitswerkbank mit laminarer Strömung, um die Sterilität zu erhalten, und extrahieren Sie genomische DNA mit einem genomischen DNA-Isolationskit.
- Amplifizieren Sie genomische DNA, die aus dem Ohrstück extrahiert wurde, in einem 20-μl-Reaktionsgemisch zum Screening auf HSV-TK-Transgen unter Kontrolle des humanen Albumin-Promotors durch Zugabe von 1 μl Forward Primer 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL Reverse Primer 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL FAM-Sonde 5'-FAM-AATCGCCCCGGCTGC-MGB-3', und 10 μl Mastermix auf einem Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsinstrument (PCR).
- Stellen Sie die Real-Time-PCR-Einstellungen wie folgt ein: 60 °C für 30 s (Preread-Stufe), 95 °C für 10 min (Hold-Phase), 40 Zyklen à 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 min (PCR-Stufe) und 60 °C für 30 s (Postread-Stufe).
Anmerkung: Ein Zyklus der Schwelle (Ct) unter 22 wird als positiv für das HSV-TK-Transgen angesehen.
- Behandlung mit Ganciclovir und Treosulfan
- Injizieren Sie den TK-NOG-Mäusen mit einer 27-g-Nadel 2x täglich an Tag 7 und an Tag 5 intraperitoneale GCV-Injektionen (6 mg/kg) in 100 μl Kochsalzlösung, bevor Sie operiert werden, um die transgenen Parenchymzellen der Mäuse zu depletieren (wie in der experimentellen Strategie in Abbildung 2 gezeigt).
- An den Tagen 3, 2 und 1 vor der Operation wurden Mäuse mit einer 27-g-Nadel mit nicht-myeloablativen intraperitonealen Dosen von Treosulfan (1,5 g/kg/Tag) in 100 μl Kochsalzlösung vorkonditioniert.
- Einen Tag vor der Operation entnehmen Sie zwei bis drei Tropfen (~100 μl) Blut aus der Vena submandibula, indem Sie sie mit einer 5-mm-Lanzette einstechen, und isolieren Sie das Serum, indem Sie es zentrifugieren (1.500 x g für 10 min bei 4 °C) für den Alaninaminotransferase (ALT)-Assay, um den Grad der Leberschädigung zu beurteilen.
- Vorbereitung auf die Operation
- Verwenden Sie eine Haarschneidemaschine, um das Fell der Maus um die Inzisionsstelle (links von der Bauchfellwand) vor der Operation zu rasieren.
- Stellen Sie den Sauerstofffluss auf 1 l/min und den Isofluranfluss auf 3% - 5% in einer Induktionskammer mit einem Mausanästhesiegerät ein. Legen Sie jeweils eine Maus zur Anästhesie in die Induktionskammer.
- Befestigen Sie das eine Ende eines sterilen Verlängerungsschlauchs (mit einer Aufnahmekapazität von 550 μl Suspension; siehe Materialtabelle für Spezifikationen) an einer 30-g-Nadel und das andere Ende an einer 1-ml-Spritze.
- Füllen Sie die Spritze mit der Suspension (80 μl/Maus) aus gepoolten HEPs und HSPCs (siehe Abschnitt 2), setzen Sie die Spritze in die Kerbe einer Pipette mit wiederholter Abgabe ein und stellen Sie den Dispenser so ein, dass in jeder Presse 10 μl abgegeben werden.
- Sobald die Mäuse betäubt sind (in der Regel nach 3 - 4 Minuten), schalten Sie den Isofluranfluss auf den Nasenkonus um und reduzieren Sie die Isofluranflussrate auf 2% - 3%.
- Intrasplenische Transplantation von humanen HSPCs und Hepatozyten bei Mäusen
- Führen Sie alle Operationsschritte in einem Laminar-Flow-Schrank unter sterilen Bedingungen durch.
- Legen Sie ein sauberes, steriles Tuch auf die Arbeitsfläche und schrubben Sie die linke Körperseite jeder Maus mit 10 % Povidon-Jod, gefolgt von 70 % Isopropylalkohol, bevor Sie einen Schnitt vornehmen.
- Machen Sie mit einer Vanna-Schere einen kleinen Schnitt (~1 - 1,5 cm lang und 5 mm tief) in die Haut, den Muskel und das Bauchfell links von der Bauchhautwand, um in die Bauchhöhle etwa 5 mm unterhalb des unteren Randes des Brustkorbs einzudringen.
- Lokalisieren Sie die Milz, ziehen Sie sie leicht mit einer Pinzette in den Operationsbereich, um einen einfachen Zugang zu erhalten, und führen Sie die 30-G-Nadel in den unteren Pol der Milz ein.
- Entriegeln Sie den Kolben der Dosierpipette und geben Sie jeweils 10 μl des Volumens ab, mit einem Limit von 60-80 μl pro Milz. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück und schneiden Sie die Milz mit Ligaturklammern mit einem Ligaturapplierer ab.
- Schieben Sie die Milz mit Applikatoren mit Wattespitze, die mit sterilem PBS benetzt sind, zurück in die Körperhöhle.
- Verschließen Sie die Muskelschicht der Bauchdecke mit einer resorbierbaren Naht, die das Nahtmuster unterbricht (nicht durchgehend). Erreichen Sie den Hautverschluss mit einem unterbrochenen Nahtmuster unter Verwendung nicht resorbierbarer Nähte.
