>1. Erzeugung und Validierung von Einzelketten-Fab-Antikörpern (scFab)-CARs.
HINWEIS: CARs enthalten typischerweise 3 kritische Domänen – eine Antigen-Targeting-Domäne, eine Spacer-/Transmembran-Domäne und eine zytoplasmatische Signaldomäne. Das genaue Design jedes CAR hängt vom beabsichtigten Ziel ab und wird daher, abgesehen von den Schlüsselmerkmalen des Konstrukts, die für die Erzeugung des Retrovirus relevant sind, in diesem Protokoll nicht im Detail beschrieben. Abbildung 1 zeigt das Gesamtdesign der CARs, die für die unten beschriebenen Studien verwendet wurden. Kurz gesagt, die Zieldomäne umfasst die gesamte leichte Kette und die variable und CH1-Domäne der schweren Kette des monoklonalen Mutterantikörpers, der durch einen halbstarren Linker verbunden ist. Die Spacer/Transmembran-Domäne stammt von Maus-CD28, und die Signaldomäne ist eine Fusion, die Elemente von Maus-CD28, CD137 (4-1BB) und CD247 (CD3ζ) enthält. Diese Elemente werden durch molekularbiologische Standardverfahren wie die Spleißüberlappung, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder die Synthese eines geeigneten "Genblocks" zusammengesetzt. Details zur Generierung des mAB287 CAR sind in Zhang et al. enthalten. Die cDNA-Sequenzen können auf Anfrage bei den Autoren angefordert werden.
- Zusammenbau des CAR-Konstrukts
- Synthetisieren Sie den Ziel-Einzelketten-Fab-Antikörper (scFab) und die kombinierten Spacer-/Signaldomänen separat und verwenden Sie eine "3-Punkt"-Ligationstechnik, um das endgültige Konstrukt zusammenzusetzen (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Hauptanforderung an das CAR-Insert besteht darin, dass es flankierende Restriktionsendonukleasestellen enthalten sollte, die eine Ligation in den retroviralen Expressionsvektor pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II) ermöglichen, oder ein verwandtes Derivat sind ebenfalls geeignet.
- Validierung der CAR-Oberflächenexpression
- Transduzieren Sie die Hybridomzellen mit pMIG II-abgeleiteten retroviralen Partikeln, die durch ein Standardprotokoll (z. B. Holst et al.) erzeugt wurden.
- Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse durch, um die Expression von GFP aus dem CAR-Vektor nachzuweisen.
- Färbungsoberflächenexpression des CAR der transduzierten Hybridome unter Verwendung von markierten Antikörpern gegen die κ-Kette der Maus (z.B. Klon RMK-45).
- Validierung der CAR-Spezifität
- Stimulieren Sie die transduzierten Hybridomzellen mit geeigneten plattengebundenen oder zellulären Antigenen. Nach der Co-Kultur über Nacht werden Überstände und sezernierte Zytokine gesammelt und mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) untersucht.
HINWEIS: Im Idealfall sollte jedes CAR unabhängig validiert werden, bevor es für die Transduktion verwendet wird. In diesem Schritt kann das Experiment angehalten und später neu gestartet werden.
>2. Transfektion viraler Produzentenzellen (Tag - 4 bis Tag 3)
HINWEIS: Retroviren werden mit Hilfe von Phoenix-ECO-Zellen hergestellt (siehe Materialtabelle). Es sind geeignete Vorsichtsmaßnahmen für die Erzeugung potenziell infektiöser Erreger zu treffen (vorzugsweise einschließlich eines ausgewiesenen Schranks der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) und eines separaten Inkubators für die Kultivierung transfizierter/transduzierter Zellen).
- Auftauen von Phoenix-Zellen (Tag -4)
- Tauen Sie 2 x 106 Phoenix-Eco-Zellen auf. Erhöhen Sie die Anzahl der Phoenix-Zellen, wenn mehrere Transduktionen geplant sind.
- Verteilen Sie sie in eine 10 cm große Gewebekulturschale mit 10 ml Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS)).
- Passage Phoenix-Zellen (Tag -3)
- Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es mit 5 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS).
- 3 ml 0,25 % Trypsin zugeben und bei 37 °C unter 10 % CO2 -Atmosphäre 3 min inkubieren.
- Ernten Sie die Zellen und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation für 3 min bei 200 x g. Die Zellen werden wieder mit 10 mL frischem Medium beschichtet und bei 37 °C inkubiert.
- Bestrahlung von Phoenix-Zellen (Tag -1 nachmittags)
- Um eine weitere Zellteilung zu minimieren, sammeln Sie Phoenix-Zellen wie in Schritt 2.2 beschrieben, resuspendieren Sie sie in 5 mL Medium und bestrahlen Sie die Zellen auf Eis (1000 rad) mit Gammastrahlen.
HINWEIS: Bei Strahlenarbeiten ist Vorsicht geboten, um eine Exposition des Personals zu vermeiden.
- Die bestrahlten Zellen zentrifugieren, in frischem Medium resuspendieren, bei 2 x 106 Zellen (in 10 ml Medium)/Platte/CAR plattieren und inkubieren.
- Transfektion (Tag 0 - morgens)
- Aspirieren Sie den Überstand aus den Phoenix-Zellen, waschen Sie ihn mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und geben Sie vorsichtig 7 ml reduziertes Serummedium (z. B. Opti-MEM) tropfenweise an die Seitenwand der Platte, um eine Störung der Monoschicht zu vermeiden. Übertragen Sie die Zellen zurück in den Inkubator.
- Nehmen Sie zwei 14-ml-Polypropylen-Röhrchen mit rundem Boden und fügen Sie jeweils 1,5 ml reduziertes Serummedium hinzu. Geben Sie 40 μl Transfektionsreagenz in ein Röhrchen (siehe Materialtabelle).
- In das andere Röhrchen geben Sie 15 μg Ab-CAR-Plasmid (erzeugt in Schritt 1) und 5 μg Hüll- und Verpackungsplasmid (5 μg pCL-Eco). Röhrchen bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
- Geben Sie die Transfektionsreagenzmischung aus Schritt 2.4.2 tropfenweise in das zweite Röhrchen, ohne die Röhrchenseiten zu berühren, und mischen Sie, indem Sie die Lösung 3 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren. Bei Raumtemperatur mindestens 20 min inkubieren.
- Geben Sie 3 ml der Mischung tropfenweise in die Phoenix-Zellen und geben Sie sie in einen Gewebekultur-Inkubator.
- Nach 4–5 Stunden fügen Sie 1 ml FCS hinzu. Zellen über Nacht bei 37 °C kultivieren.
- Mittlerer Wechsel (Tag 1)
- Der Überstand, der die Plasmid-/Transfektionsreagenzkomplexe enthält, ist zu entfernen und gemäß den institutionellen Verfahren für den Umgang mit infektiösem Material zu entsorgen. Geben Sie 4 ml frisches, vorgewärmtes Kulturmedium zu den Zellen.
- Ernte des Virus für die Transduktion (Tag 2)
- Sammeln Sie das virushaltige Medium mit einer sterilen Spritze aus den Phoenix-Zellen, filtern Sie es (0,45 μm), um verbleibende Zelltrümmer zu entfernen, und sammeln Sie es in einem neuen Röhrchen.
- Geben Sie rekombinanten humanen Interleukin-2 (rhIL-2)-Stamm zu einer Endkonzentration von 200 internationalen Einheiten (IE)/ml hinzu. Verwenden Sie das Virus sofort zur Transduktion (Schritt 5.3). Geben Sie 4 ml frisches Medium zu den Phoenix-Zellen und geben Sie es in den Inkubator.
- Wiederholte Virussammlung (Tag 3)
- Wiederholen Sie Schritt 2.6, aber entsorgen Sie Phoenix-Zellen als infektiösen Abfall, anstatt frisches Medium hinzuzufügen. Dieser Überstand wird in Schritt 5.4 verwendet.
>3. Isolierung und Aktivierung von primären CD8-T-Zellen (Tag -1 bis Tag 0)
HINWEIS: Zuvor wurden CD8-T-Zellen von weiblichen nicht-adipösen Diabetiker-Mäusen (NOD) nach 4–5 Wochen gesammelt, einem Zeitpunkt bevor die Inselentzündung beginnt. Behandeln Sie alle Mäuse gemäß den vom Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) genehmigten Protokollen. CD8-T-Zellen werden mit einem kommerziellen Negativ-Selektionskit aus Splenozyten angereichert.
- Beschichtung der Platten mit CD3/CD28-Antikörpern (Tag -1)
- Geben Sie 1 ml einer Mischung aus Anti-Maus-CD3- und CD28-Antikörpern (beide mit 1 μg/ml in PBS) in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie die Platten am nächsten Tag 3 Mal mit 1 mL sterilem PBS, bevor Sie die murinen CD8-T-Zellen hinzufügen (Schritt 4.1).
HINWEIS: Die Anzahl der zu beschichtenden Vertiefungen variiert für jedes Experiment, abhängig von der Gesamtzahl der erforderlichen aktivierten CD8-T-Zellen.
- Entnahme von Splenozyten (Tag 0)
- Euthanasieren Sie zwei weibliche NOD-Mäuse im Alter von 4–5 Wochen durch CO2 -Inhalation, gefolgt von der Enthauptung. Ernten Sie die Milz und geben Sie sie auf ein Zellsieb, indem Sie 10 ml PBS in einer Zellkulturschale auf dem Eis einweichen.
- Schneiden Sie in einer Zellkulturhaube jede Milz in 3-5 Stücke, drücken Sie das Gewebe mit einem sterilen Kolben einer 3- oder 5-ml-Spritze, um die Milzfragmente auseinander zu drücken und die Zellen durch das Drahtgeflecht passieren zu lassen.
- Entfernen Sie sanft rote Blutkörperchen, indem Sie Splenozyten in 1:4 verdünntem Erythrozyten-Lysepuffer (1 ml Lysepuffer in 3 ml PBS für eine Milz) resuspendieren und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
- Verdünnen Sie dann 10 μl der Zellsuspension mit Trypanblau-Farbstofflösung zur Zellzählung mit einem Hämozytometer und pelletieren Sie den Rest der Zellen durch Zentrifugation bei 350 x g für 7 Minuten.
- Anreicherung von CD8-T-Zellen (Tag 0)
- Reichern Sie CD8-T-Zellen durch Negativselektion mit einem CD8-T-Zell-Isolationskit der Maus gemäß den Anweisungen des Herstellers an.
HINWEIS: Um eine hohe Reinheit zu gewährleisten, runden Sie bei der Berechnung des Volumens des hinzuzufügenden biotinylierten Antikörpers immer die Zellzahlen auf (verwenden Sie z. B. das für 108 Zellen empfohlene Volumen der Reagenzien für berechnete 9,1 x 107 Zellen).
- Zellpellets in 400 μl Puffer und 100 μl Biotin-Antikörper-Cocktail pro 1 x 108 Zellen suspendieren, gut mischen und 5 min im Kühlschrank (4 °C) inkubieren, um die Antikörperbindung zu ermöglichen.
- 300 μl Markierungspuffer und 200 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen pro 1 x 108 Zellen zugeben, gut mischen und 10 min bei 4 °C inkubieren.
- Während Sie auf die Mikroperlenbindung warten, setzen Sie die Trennsäule auf den Separator. Waschen Sie die Säule, indem Sie mit 3 mL Etikettierpuffer spülen.
- 1000 μl der Bead/Zell-Mischung werden durch ein 40 μm Zellsieb geleitet, bevor sie auf die Trennsäule geladen werden, um Zellaggregate zu entfernen. Sammeln Sie den Durchfluss der Säule in einem vorgekühlten 15-ml-Röhrchen.
- Waschen Sie die Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers und sammeln Sie das gesamte Abwasser in demselben Rohr. Bestimmen Sie die Zellzahl (wie in Schritt 3.2.4) und sammeln Sie durch Zentrifugation bei 350 x g für 5 min. Waschen Sie die Zellen, indem Sie in 2 ml vollständiges T-Zellmedium (RPMI-1640 mit FCS, 2-Mercaptoethanol, rhIL-2 (200 U/ml), Maus-Interleukin-7 (mIL-7, 0,5 ng/ml), ITS, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES) und Penicillin-Streptomycin) resuspendieren und 5 Minuten lang bei 350 x g zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie die Zellen in vorgewärmtem (37 °C) vollständigem T-Zellmedium in einer Konzentration von 0,25–0,5 x 106/ml.
>4. Aktivierung von T-Zellen (Tag 0 bis 2)
- Geben Sie 2 ml der Zellsuspension (0,25–0,5 x 106/ml) in jede beschichtete Vertiefung der CD3/CD28-Antikörper-beschichteten 24-Well-Platte aus Schritt 3.1.2. Verwenden Sie eine wirbelnde Bewegung, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
HINWEIS: Fügen Sie die Zellen mit einer wirbelnden Bewegung hinzu, um sie gleichmäßig zu verteilen und Kanteneffekte zu minimieren. Wenn sich die Zellen am Rand der Vertiefungen ansammeln, werden sowohl die Transduktionsrate als auch die Zellviabilität verringert.
- Als Kontrolle wird die gleiche Anzahl von CD8-T-Zellen in eine einzelne unbeschichtete Vertiefung der Platte plattiert. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit einem 10% CO2 -begasten Inkubator für 48 h.
HINWEIS: Nach 48 h kann die Aktivierung mit einem Mikroskop bestätigt werden; Die aktivierten Zellen sind größer als die Zellen, die nicht auf Anti-CD3/CD28-Antikörper gestoßen sind.
>5. Transduktion von aktivierten CD8 T-Zellen (Tage 1 bis 3)
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet eine Spin-Transduktionsmethode. Erforderlich ist eine Zentrifuge mit Ausschwingrotor und Gewebekulturplattenadaptern, die in der Lage ist, eine Innentemperatur von 37 °C zu halten. Um eine maximale Effizienz zu gewährleisten, wird die Zentrifuge am Tag der Transduktion auf 37 °C vorgewärmt, bevor das Virus aufgefangen wird.
- Vorbereitung von humanen Fibronektin-Fragment-beschichteten Platten (Tag 1 bis Tag 2)
- An Tag 1 werden 0,5 ml Fibronektin (50 μg/ml in PBS) in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. < br / >
HINWEIS: In der Regel sind zwei mit Fibronektin beschichtete Wells pro Platte transfizierter Phoenix-Zellen erforderlich.
- Entfernen Sie an Tag 2 die Fibronektinlösung und ersetzen Sie sie durch 1 ml 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, um unspezifische Bindungsstellen zu "blockieren".
- Waschen Sie die behandelten Vertiefungen mit 1 ml sterilem PBS. Nach dem Entfernen der Waschlösung ist die Platte gebrauchsfertig; oder kann versiegelt und bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
- Entnahme von aktivierten CD8-T-Zellen (Tag 2)
- Ernten Sie die aktivierten CD8-T-Zellen, zählen und berechnen Sie die Zellviabilität mit Trypanblau oder einem geeigneten automatisierten Instrument.
- Zellen durch Zentrifugation sammeln und bei 5 x 106 lebensfähigen Zellen/ml für die Transduktion resuspendieren. Halten Sie ein kleines Aliquot von Zellen in Kultur im vollständigen T-Zellmedium im CO2 -Inkubator, um eine Kontrolle für die anschließende fluoreszenzaktivierte Zellsortierung der transduzierten Zellen zu ermöglichen (Schritt 6).
HINWEIS: Nach der Aktivierung für 48 Stunden sollte sich die Gesamtzahl der Zellen um etwa das 1,5-fache erhöht haben und eine Lebensfähigkeit von mehr als 95 % aufweisen.
- Transduktion (Tag 2)
- Geben Sie 100 μl aktivierte CD8-Zellsuspension pro Vertiefung (0,5 x 106 Zellen) in die mit Fibronektin beschichtete Platte. Geben Sie dann 1,5–2 ml virushaltiges Medium (aus Schritt 2.6) in jede Vertiefung. Mischen Sie mit einer wirbelnden Bewegung, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen (Abbildung 2).
- Legen Sie die Platte in eine Plastiktüte mit Reißverschluss und verschließen Sie sie (um eine sekundäre Eindämmung zu gewährleisten). Zentrifugieren Sie bei 2000 x g für 90 min bei 37 °C.
- Nehmen Sie die Platte aus der Zentrifuge. In der biologischen Sicherheit entfernen Sie vorsichtig die Plastiktüte und stellen Sie sicher, dass die Außenseite der Platte nicht mit Medien verunreinigt ist.
- Übertragen Sie dann die Platte in den speziellen 37 °CCO 2 -Inkubator. Entfernen Sie nach 4 Stunden 1 ml des Mediums aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 1 ml vorgewärmtes vollständiges T-Zell-Medium. Setzen Sie die Platte wieder in den CO2 -Inkubator ein.
HINWEIS: Behandeln Sie alle Medien aus den transduzierten Zellen als infektiösen Abfall.
