>1. Mikroinjektion von Zebrafischembryonen mit Bakterien und Phagencocktail
HINWEIS: Um eine systemische Infektion durchzuführen, muss der Embryo eine Blutzirkulation haben, die normalerweise nach 26 hpf beginnt.
- Nach 26 hpf werden die Embryonen mit Pronaselösung dechorioniert, die durch Auflösen von Pronasepulver in E3-Medium in einer Konzentration von 2 mg/ml hergestellt wurde. Pipettieren Sie die Embryonen vorsichtig, um das Chorion zu brechen. Entsorgen Sie das Pronase/E3-Medium und spülen Sie das Gericht mehrmals mit frischem E3 aus, um alle Pronase zu entfernen.
- Betäuben Sie Zebrafischembryonen in Tricain-haltigem E3-Medium ca. 5 min vor der Injektion.
- Pipettieren Sie die anästhesierten Embryonen in die in Schritt 1 vorbereitete Spur. Verwenden Sie eine feine Gelladespitze, um die Embryonen in der seitlichen Position auszukleiden.
- Eine Mikroinjektionsnadel mit ca. 5 μl des P. aeruginosa-Präparats bestücken.
- Führen Sie die Nadel dorsal bis zum Ausgangspunkt des Cuvier-Gangs ein, wo sie sich über den Dottersack auszubreiten beginnt. Injizieren Sie ein Volumen von 1-3 nL und stellen Sie sicher, dass sich das Volumen direkt im Kanal ausdehnt und in den Kreislauf gelangt.
- Etwa nach jeweils 50 injizierten Embryonen wird ein Tropfen der Bakterien in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 100 μl sterilem PBS injiziert, um zu überprüfen, ob das Injektionsvolumen gleich bleibt. Das Inokulum wird über Nacht bei 37 °C auf LB-Agar (siehe Tabelle 1) plattiert, um die KBE zu beurteilen.
- Die mikroinjizierten Embryonen werden in zwei saubere Petrischalen mit frischem E3-Medium + PTU (Tabelle 1) übertragen und bei 28 °C inkubiert.
- Zu zwei ausgewählten Zeitpunkten: 30 min oder 3 h nach der bakteriellen Injektion eine der Petrischalen mit bakteriell injizierten Embryonen aus dem Inkubator entnehmen und in der Spur ausrichten, wie in 6.3 für die Phagen-Cocktail-Injektion beschrieben.
- Beladen Sie eine Mikroinjektionsnadel mit ca. 5 μl des Phagencocktails (Mischung aus vier Phagen, die den Stamm PAO1 infizieren) mit einer feinen Gelladespitze und fixieren Sie sie am Mikroinjektor.
- Injizieren Sie den Phagencocktail in den Cuvier-Kanal der Embryonen, denen zuvor Bakterien injiziert wurden.
- Übertragen Sie die mikroinjizierten Embryonen in zwei saubere Petrischalen mit frischem E3-Medium + PTU und inkubieren Sie sie bei 28 °C.
Tabelle 1: Herstellung von Lösungen
| Lösungen | Präparat |
| Anästhesie-Stammlösung 25X | 4 mg/ml Tricain in destilliertem H2O. |
| Anästhesie-Arbeitslösung 1X | Die Tricain-Stammlösung 25-fache Zubereitung wird in destilliertem H2O verdünnt, um die 1-fache Konzentration (0,16 mg/ml) von destilliertem H2O zu erreichen. |
| CsCl d=1,3 | 20,49 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1,4 | 20,28 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1,5 | 34,13 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1,6 | 41,2 g in 50 mL TN |
| E3-Embryomedium für Zebrafischembryo | 1 L 1 von E3 (verdünnen Sie die 50-fache Brühe mit destilliertem H2O) + 200 μl 0,05 % Methylblau. Bei RT lagern. |
| E3-Embryo-Medium Stammlösung (50X) | 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 und 9,95 g MgSO4 in 5 l destilliertem H2O. Bei RT lagern. |
| LB-Agar | 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 10 g/l Agar |
| LB Brühe | für 1L: 950 mL H2O, 10 g Trypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt |
| PBST | PBS 1X + Triton X 1% |
| Physiologische Lösung | 0,9 % NaCl |
| Pigmentierungsblockierende Stammlösung 10X | 0,3 mg/ml Phenylthioharnstoff (PTU) Pulver im E3-Embryomedium für Zebrafischembryonen |
| Pronase-Stammlösung 5X | 5 mg/ml Pronasepulver in E3-Embryomedium für Zebrafischembryonen |
| TN-Puffer | 10 mM Tris HCl pH 8,0, 150 mM NaCl |
