Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Tieren
- Verwenden Sie 132 2 Monate alte männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 320-450 g (120 Ratten für Experimente und 12 Ratten für Blutproben, Abbildung 1). Fünfzehn Ratten für jede Gruppe reichten für eine Trennschärfe von 0,8 (80% Chance, eine statistische Signifikanz zu finden, wenn der angegebene Effekt vorhanden ist).
- Bringen Sie alle Ratten in klassischen Käfigen unter Isolationsbedingungen in einer konventionellen Anlage unter, die mit einer Wickelstation ausgestattet ist. Initiieren Sie die Zucht in einem IVC-Gestell (individuell belüfteter Käfig), wobei Ratten mit Lichtschutzfaktor (spezifisch pathogenfrei) speziell gekauft werden.
- Verwenden Sie folgende Gehäusebedingungen: Temperaturbereich von 19-24 °C; relative Luftfeuchtigkeit: 40-60%; Lüftung: Häufigkeit des Luftwechsels: 10-15 pro h; Hell-Dunkel-Zyklus: 12 h-12 h.
- Sterilisieren Sie alle Käfiggeräte und verwenden Sie bestrahlte Einstreu. Implementieren Sie die Käfiganreicherung systematisch, indem Sie sterile Pappschalen und Handtücher in die Käfige legen.
- Erlauben Sie den Zugang zur Zone unter eingeschränkten Bedingungen: neuer Laborkittel, Maske, Handschuhe, Schuhe und Haarhaube am Eingang.
- Führen Sie jährlich eine Überwachung des Gesundheitszustands der Bienenvölker von Wächtern durch, die auf schmutziger Einstreu untergebracht sind, gemäß den Felasa-Empfehlungen für konventionelle Einrichtungen. Halten Sie vier bis fünf Tiere pro Käfig mit dem entsprechenden bestrahlten Futter und geben Sie angesäuertes Wasser ad libitum. Täglich überwachen.
- Verlegen Sie Ratten, die für einen chirurgischen Eingriff in filtrierenden oberen Käfigen ausgewählt wurden, 2 Stunden vor der Operation in die Operationssäle.
>2. Chirurgischer Eingriff
- Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente vor: eine feine Schere, eine Klemme, zwei hämostatische Klemmen und einen Nadelhalter. Tragen Sie bei allen Eingriffen Handschuhe, eine Maske, eine Haube und einen Laborkittel.
- Teilen Sie die Ratten nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen (PRP und Kochsalzlösung) ein.
- Nimm die Ratte aus ihrem Käfig und wiege sie. Verwenden Sie nummerierte Ohrmarken, um die Ratten zu identifizieren. Um ein Austrocknen der Augen zu vermeiden, geben Sie Wassertropfen auf die Hornhaut.
- Betäuben Sie die Ratte intraperitoneal mit Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht). Setzen Sie die Tiere unter kardiorespiratorische Überwachung, um die Anästhesie zu bestätigen und auf Augenreflexe zu prüfen.
- Injizieren Sie 50 μl Buprenorphin subkutan (0,01-0,05 mg/kg alle 8-12 h) als Schmerzmittel in den Halsbereich.
- Rasieren Sie die linke Hintergliedmaße mit einem Elektrorasierer, desinfizieren Sie sie mit 3 abwechselnden Peelings Iso-Betadin/Alkohol (1:10 verdünnt) und legen Sie die Ratte auf ein warmes Pad (20 °C) unter ein Präpariermikroskop. Setzen Sie die Ratte auf den lateralen Dekubitus, wobei sich das zu operierende Bein in einer überlegenen Position befindet. Halten Sie die Pfote mit einer chirurgischen Zange fest.
- Machen Sie mit der Schere einen kleinen seitlichen Schnitt (20-25 mm) in die Haut, die die linke Achillessehne umgibt, und präparieren Sie die Faszie mit einer feinen Schere, um den Achillessehnenkomplex freizulegen (Abbildung 2a).
- Entfernen Sie die Plantarissehne mit einer Schere (Abbildung 2b).
- Schneiden Sie die Achillessehne quer 5 mm proximal zu ihrem Fersenbeinansatz ab und entfernen Sie einen 5 mm langen Abschnitt mit einer Schere. Die Sehne nicht vernähen (Abbildung 2c, 2d).
- Vernähen Sie die Faszie und die Haut mit resorbierbarem Garn und führen Sie eine Overjet-Naht (kontinuierliche Naht) durch. Monofile Nähte können auch verhindern, dass sie von der Haut in den chirurgischen Schnitt gelangen.
- Stellen Sie die Ratte bis zum Aufwachen unter eine Heizlampe und setzen Sie sie dann wieder in einen Käfig (58 x 38 cm) (Nota bene: Es wird keine Immobilisierung auferlegt).
>3. PRP-Vorbereitung
- Betäuben Sie die Spenderratten mit Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht) durch intraperitoneale Injektion. Die PRP-Injektion wird 2 h postoperativ ohne erneute Betäubung durchgeführt.
- Injizieren Sie 50 μl Buprenorphin subkutan als Schmerzmittel.
- Vollblut (20 ml pro Ratte, endgültige Blutung) durch Herzpunktion in sterile Röhrchen mit 3,2 % gepuffertem Natriumcitrat (0,109 M, Antikoagulans) sammeln. Dann wird die Ratte durch intrakardiale Injektion eingeschläfert.
- Um PRP zu erhalten, zentrifugieren Sie das Blut 10 Minuten lang bei 150 x g und Raumtemperatur. Dieser erste Zentrifugationsschritt mit niedriger Geschwindigkeit ergibt zwei unterschiedliche Phasen: eine untere Phase, die aus roten Blutkörperchen (RBCs) besteht, die etwa 80-90 % des Gesamtvolumens ausmachen, und eine obere Phase, die aus plättchenreichem Plasma (PRP) besteht (typischerweise 10-20 % der Blutprobe).
- Sammeln Sie das PRP (obere Phase) in einem sekundären Kunststoffröhrchen mit einer Kunststoff-Transferpipette. Da die Grenzfläche zwischen PRP und roten Blutkörperchen sehr locker ist, pipettieren Sie nicht zu nahe an der Grenzfläche. Bei sachgemäßer Handhabung sollten kontaminierende Erythrozyten in PRP unter 0,05 x 103 Zellen/μl liegen. Entsorgen Sie die verbleibende untere Phase und das primäre Blutentnahmeröhrchen.
- Bestimmen Sie das Volumen des gesammelten PRP und messen Sie die Thrombozytenzahl auf einem Hämatologie-Analysator. Diese Werte werden für Berechnungen benötigt, um die Thrombozytenkonzentration im nächsten Schritt anzupassen. Eine Blutzellzahl ist auch hilfreich, um eine mögliche Kontamination mit Erythrozyten und Leukozyten zu bewerten. Die Thrombozytenkonzentration in PRP beträgt in diesem Stadium typischerweise 1 – 1,5 x106/μl.
- Führen Sie eine zweite Zentrifugation des PRP für 10 min bei 1.000 x g und Raumtemperatur durch. Dieser Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsschritt ergibt ein loses Thrombozytenpellet und einen Überstand aus autologem plättchenarmem Plasma (PPP). Unter Verwendung der in Schritt 3.6 ermittelten Werte wird das Volumen des Überstands berechnet, das verworfen werden muss, um das PRP zu konzentrieren und eine Endkonzentration von 2,5 x 106/μl zu erreichen.
- Der Überstand (PSM) wird vorsichtig mit einer Kunststoff-Transferpipette in einem Sekundärröhrchen aus Kunststoff aufgefangen, wobei etwa zwei Drittel des in Schritt 3.7 berechneten Endvolumens übrig bleiben. Da das Pellet lose ist, geht bei der Entsorgung von Pflanzenschutzmittel eine erhebliche Menge an Blutplättchen verloren, wodurch möglicherweise die gewünschte Konzentration verringert wird.
- Das Plättchenpellet mit dem restlichen Überstand durch vorsichtiges wiederholtes Pipettieren vorsichtig resuspendieren. Messen Sie die Thrombozytenzahl an diesem konzentrierten PRP. Falls erforderlich, das entsprechende Volumen an autologem PSM zugeben, um die endgültige Zielkonzentration zu erreichen.
Anmerkung: Verwenden Sie das PRP innerhalb von 3 Stunden nach der Zubereitung.
- Fügen Sie 50 μl CaCl2 (11 mÄq 10 ml) pro ml PRP hinzu, um die Blutplättchen zu aktivieren.
- Injizieren Sie ca. 1 h nach der Präparation 50 μl frische PRP- oder Kochsalzlösung mit einer 21G-Nadel direkt in die vernähte Operationsstelle. Bewahren Sie PRP während dieser Zeit bei Raumtemperatur auf.
- Überwachen Sie die funktionelle Wiederherstellung der Ratten in den Tagen nach der Operation und vor der Entfernung der Achillessehne genau.
