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>1. Synthese von Poly(beta-Aminoestern) (pBAE) Polymer mit Endoligopeptiden (OM-pBAE)
- Polymerisation von C6-pBAE
- Fügen Sie 5-Amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-Hexylamin (38 mmol; MW = 101,19 Da) in einen Glaskolben mit rundem Boden (100 mL). Fügen Sie dann 1,4-Butandiol-Diacrylat (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Das Silikonölbad auf 90 °C vorheizen, den Rundkolben in das Ölbad stellen und die Mischung mit Hilfe eines Magnetrührstabs über Nacht (~18 h) umrühren. Nehmen Sie dann das Produkt aus dem Rundkolben und stellen Sie es bei -20 °C in den Gefrierschrank.
Anmerkung: Das Produkt liegt in Form eines klebrigen Pulvers vor und wird mit Hilfe eines Spatels aus dem Kolben genommen. Es ist wichtig, die Struktur des erhaltenen Polymers durch 1H-NMR zu validieren. Die NMR-Spektren wurden in einem 400 MHz Gerät (siehe Materialtabelle) unter Verwendung von Chloroform-d und D2O als Lösungsmittel aufgenommen. Etwa 10 mg jedes Poly(β-Aminoesters) wurden entnommen und in 1 ml des deuterierten Lösungsmittels gelöst.
- Reaktion mit Peptiden zur Gewinnung von OM-pBAE
- Geben Sie 25 mL 0,1 M HCl zu ausgewählten Peptiden, z. B. Peptid Cys-His-His-His mit Trifluoressigsäure (TFA, 200 mg), in ein zuvor gewogenes 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das einer Gefriertrocknung standhalten kann, und rühren Sie über Nacht manuell um, um eine klare Lösung zu erhalten.
- Die Lösung wird bei -80 °C für 1 h eingefroren und das resultierende Peptidhydrochlorid gefriergetrocknet.
HINWEIS: Prüfen Sie, ob das Endgewicht dem theoretischen Wert entspricht.
- Eine Lösung von C6-pBAE (0,031 mmol) in Dimethylsulfoxid herstellen. Stellen Sie auch eine Lösung des Peptidhydrochlorids (0,078 mmol) in Dimethylsulfoxid her.
- Mischen Sie die beiden Lösungen in einem Schraubverschlussröhrchen und schrauben Sie den Deckel auf. Die Mischungslösung wird in einem Wasserbad mit einer kontrollierten Temperatur von 25 °C 20 h lang mit einem Magnetrührstab gerührt.
- Die Mischung zu 7:3 (v/v) Diethylether/Aceton geben. Die resultierende Suspension wird bei 25.000 x g bei 4 °C zentrifugiert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Waschen Sie anschließend den Feststoff zweimal mit 7:3 (v/v) Diethylether/Aceton. Trocknen Sie das Produkt dann unter einem Vakuum (<0,2 atm).
- Stellen Sie eine Lösung von 100 mg/ml des Produkts in Dimethylsulfoxid her. Das resultierende Produkt trägt die Bezeichnung C6-Peptid-pBAE. Es ist wichtig, die Struktur des erhaltenen Polymers durch 1H-NMR zu validieren, um das Verschwinden der Olefinsignale zu bestätigen, die mit terminalen Acrylaten verbunden sind. Wenn es nicht verwendet wird, kann das Polymer bei -20 °C eingefroren werden.
>2. Bildung von Polyplexen
HINWEIS: Alle Eingriffe sollten in einem klimatisierten Raum durchgeführt werden, um eine konstante Temperatur zu halten.
- Tauen Sie die Polymere C6-Peptid-pBAE auf und wirbeln Sie die Lösung auf.
- Die Polymermischung wird auf und ab pipettiert und eine Lösung von 12,5 mM (V1) in Natriumacetat (NaAc) hergestellt. Dann die Mischung verwirbeln und 10 Minuten warten.
- Die Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) wird mit 0,5 mg/ml hergestellt und durch Pipettieren (V2) gemischt.
Anmerkung: Es ist entscheidend, ein Vortexen der mRNA zu vermeiden.
- Das Polymergemisch wird in der Endkonzentration vortext, um eine homogene Lösung zwischen dem Polymerbestand in Dimethylsulfoxid (DMSO) und dem Acetatpuffer zu erhalten.
Anmerkung: Die endgültige Polymerkonzentration hängt vom gewählten N/P-Verhältnis (Stickstoff-Phosphat-Gruppen) ab. Das N/P-Verhältnis hängt von der jeweils zu verwendenden mRNA ab. Für die Verkapselung eines verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) wurde beispielsweise, wie bereits berichtet, ein Verhältnis von 25:1 verwendet.
- Mischen Sie die Erbgutlösung und die C6-PeptidepBAE-Lösung (25x der mRNA-Konzentration) im Verhältnis 1:1 (Vi = V1 + V2).
Anmerkung: C6-Peptid-pBAE wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen geladen, in das die mRNA durch Auf- und Abpipettieren zum Mischen hinzugefügt wird. Nach der Zubereitung werden die Konzentrationen des Polyplex, der Nukleinsäure und des C6-Peptid-pBAE halb verdünnt.
Bei - 25 °C für 30 min in einem Thermoblock inkubieren. Fältitieren Sie mit 1:2 RNase-freiem Wasser, indem Sie die Probe in ein vorgeladenes Mikrozentrifugenröhrchen mit Wasser geben.
- Füge die Hilfsstoffe hinzu. Geben Sie das gleiche Volumen wie das Gemisch aus mRNA und pBAE (Vi) in 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) 20 mM und Saccharose 4% durch Auf- und Abpipettieren hinzu. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Probe 3x verdünnt.
>3. Lyophilisierung von Polyplexen
Die - vorherige Polyplex-Lösung sofort bei -80 °C im Gefrierschrank 1 h lang einfrieren.
- Führen Sie die Primärtrocknung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen: (1) 1 h bei -60 °C und 0,001 hPa; (2) 1 h bei -40 °C und 0,0001 hPa; (3) 4 h bei -20 °C und 0,0001 hPa; (4) 12 h bei 5 °C und 0,0001 hPa.
- Sofort bei -20 °C lagern, um eine Rehydrierung bis zur Verwendung zu vermeiden.