>1. Expression des selbstorganisierenden Protein-Nanopartikel-Kerns, der ein Sechs-Helix-Bündel (SHB-SAPN) Protein enthält, in E. coli BL21(DE3)
- Mischen Sie 95 mL der Komponente A und 5 mL der Komponente B des Mediums in einem 2 l sterilen Erlenmeyerkolben aus Glas gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Fügen Sie Ampicillin bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml hinzu.
- Beimpfen Sie das Medium mit E. coli aus einer zuvor etablierten Glycerin-Stammkultur. Inkubieren Sie die Kultur bei 30 °C und schütteln Sie sie bei 200 Umdrehungen pro Minute (U/min) für 48 h.
HINWEIS: Der verwendete E. coli BL21 (DE3)-Stamm enthielt den Ampicillin-resistenten Expressionsvektor mit dem SHB-SAPN-Gen. Obwohl das allgemeine Protokoll der Medien eine Inkubation von 24 Stunden bei 37 °C empfiehlt, ergibt eine 48-stündige Inkubation bei 30 °C eine höhere Ausbeute für SHB-SAPN.
- Übertragen Sie die Kultur in zwei konische 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4.000 x g für 10 min mit einem festen Winkelrotor bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf, um Zellen zu ernten.
HINWEIS: Das Zellpellet kann entweder sofort verarbeitet oder bis zur Verwendung bei -80 °C eingefroren werden.
>2. Lyse von E. coli BL21(DE3) durch Beschallung
HINWEIS: Verwenden Sie pyrogenfreie Kunststoffe und Glaswaren, die mindestens 30 Minuten lang bei 250 °C gebrannt werden. Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) als Reduktionsmittel bricht die Disulfidbindungen innerhalb und zwischen Proteinen auf. TCEP ist für die Puffer während dieses Protokolls notwendig, wenn das angezeigte Antigen S-S-Bindungen enthält. Nur für den SHB-SAPN-Core ist das Vorhandensein von TCEP in den Puffern nicht erforderlich.
- Bereiten Sie Imidazol-freien Puffer (8 M Harnstoff, 50 mM Natriumphosphat monobasisch, 20 mM Trisbase, 5 mM TCEP) mit einem pH-Wert von 8,0 (eingestellt mit 5 N Natriumhydroxid, NaOH) vor und filtrieren Sie ihn mit einer 0,22 μm Vakuumflaschenfiltrationseinheit.
- Die pelletierten Zellen (aus Schritt 1.3) werden mit 40 ml imidazolfreiem Puffer in einem konischen 50-ml-Röhrchen resuspendiert. Beschallung der resuspendierten Zellen mit einer Sonde auf Eis für 5 min (4 s Beschallung, 6 s Ruhe) mit einer Beschallungsleistung von 150 W.
- Das zelluläre Lysat (40 ml) wird bei 29.000 x g bei 4 °C für 25 min in einem Festwinkelrotor zentrifugiert, um einen geklärten Überstand zu erzeugen. Der Überstand wird in einen sterilen 150-ml-Kolben überführt und das Pellet verworfen. Verdünnen Sie den Überstand auf 100 mL mit dem Imidazol-freien Puffer (später im Protokoll als "Probe" bezeichnet).
HINWEIS: Dieser Verdünnungsschritt ist erforderlich, um zu verhindern, dass der Druck des Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Systems (FPLC) während der Lysatbelastung der Säule zu hoch wird.
>3. Proteinaufreinigung mit einer His-Säule
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit einem FPLC-Instrument durchgeführt, kann aber an die Schwerkraftströmung angepasst werden.
- Bereiten Sie die folgenden Puffer vor und filtrieren Sie sie mit einer 0,22-μm-Vakuumflaschenfiltrationseinheit: (i) Imidazol-freier Puffer "Puffer A" (8 M Harnstoff, 50 mM Natriumphosphat monobasisch, 20 mM Tris-Base, 5 mM TCEP) pH 8,0; ii) 500 mM Imidazol-Puffer "Puffer B" (8 M Harnstoff, 50 mM Natriumphosphat monobasisch, 20 mM Tris-Base, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol) pH 8,0; und (iii) Isopropanol-Waschung (20 mM Tris, 60 % Isopropanol) pH 8,0,
HINWEIS: Der pH-Wert für jeden Puffer wurde mit 5 N NaOH eingestellt.
- Äquilibrieren Sie die His-Spalte.
HINWEIS: Für die Produktion im Labormaßstab wird in diesem Protokoll eine vorgepackte 5-ml-His-Säule verwendet, es kann jedoch auch eine größere Säule verwendet werden.
- Öffnen Sie die FPLC-Software und klicken Sie auf die Option Neue Methode. Es öffnet sich sofort das Menü mit den Methodeneinstellungen. Wählen Sie im Dropdown-Menü für die Spaltenposition C1 Port 3 aus.
- Wählen Sie im Dropdown-Menü Shown by technique die Option Affinität aus. Wählen Sie im Dropdown-Menü Säulentyp die Option "Andere" aus: Histrap HP, 5 ml. Das Säulenvolumen und die Druckkästen werden automatisch auf die entsprechenden Werte eingestellt.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Methodengliederung. Ziehen Sie die folgenden Schaltflächen aus dem Popup-Menü der Phasenbibliothek: Äquilibrierung, Probenanwendung, Spaltenwäsche und Elution neben dem Pfeil in genau dieser Reihenfolge. Schließen Sie das Menü der Phasenbibliothek.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Äquilibrierung. Die in der Tabelle aufgeführten Werte sollten "Anfangspuffer B" (4 %), "Endpuffer B" (4 %) und "Volumen (CV)" 5 sein.
- Klicken Sie auf das Feld Beispielanwendung. Klicken Sie im Feld zum Laden der Probe auf das Optionsfeld Probe auf Säule mit Probenpumpe injizieren. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen neben dem Kontrollkästchen Durchflussrate aus Methodeneinstellungen verwenden im Feld Probeninjektion mit Systempumpe aktiviert ist. Ändern Sie den Wert neben dem Volumenfeld auf der rechten Seite des Bildschirms auf 20 ml.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Spaltenwäsche. Die in der Tabelle aufgeführten Werte sollten "Anfangspuffer B" (4 %), "Endpuffer B" (4 %) und "Volumen (CV)" 5 sein. Deaktivieren Sie neben dem Schema zur Sammlung von Fraktionen das Kontrollkästchen Aktivieren.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Elution. Die in der Tabelle aufgeführten Werte sollten "Anfangspuffer B" 0 %, "Endpuffer B" 100 % und "Volumen (CV)" 5 sein. Klicken Sie neben dem Schema für die Fraktionssammlung auf das Kontrollkästchen Aktivieren. Deaktivieren Sie die Option Fraktionsgröße in den Methodeneinstellungen verwenden und passen Sie die Fraktionsgröße im Ausfüllfeld unten auf 4 mL an.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern unter oben in der Software. Nennen Sie die Datei "Equilibration".
- Schließen Sie eine vorgepackte 5-ml-His-Säule an den entsprechenden Säulenanschluss 3 des FPLC an. Sowohl die Schläuche von Pumpe A und Pumpe B als auch die Schläuche der Probenpumpe sollten in 0,22 μm gefiltertes deionisiertes Wasser gelegt werden. Führen Sie das Äquilibrierungsprogramm aus.
- Setzen Sie sowohl Pumpe A als auch Pumpe B sowie den Schlauch der Probenpumpe in den Imidazol-freien Puffer (Puffer A) ein und führen Sie das Äquilibrierungsprotokoll erneut aus.
- Binden Sie die Probe an die Säule und reinigen Sie das Protein.
- Öffnen Sie die FPLC-Software und klicken Sie auf die Option Neue Methode. Es öffnet sich sofort das Menü mit den Methodeneinstellungen. Wählen Sie im Dropdown-Menü für Spalte die Position C1 Port 3 aus. Wählen Sie im Dropdown-Menü Shown by technique die Option Affinität aus. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Säulentyp" die Option "Andere" aus: Histrap HP, 5 mL. Das Spaltenvolumen und die Druckkästen werden automatisch auf die entsprechenden Werte gesetzt.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Methodengliederung. Ziehen Sie die Schaltflächen aus dem Popup-Menü der Phasenbibliothek: Äquilibrierung, Beispielanwendung, Spaltenwäsche (Wäsche 1), Spaltenwäsche (Wäsche 2), Spaltenwäsche (Wäsche 3) und Elution neben dem Pfeil in genau dieser Reihenfolge. Schließen Sie das Menü der Phasenbibliothek.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Äquilibrierung. Die in der Tabelle aufgeführten Werte sollten "Anfangspuffer B" 4 %, "Endpuffer B" 4 % und "Volumen (CV)" 5 sein.
- Klicken Sie auf das Feld Beispielanwendung. Klicken Sie im Feld zum Laden der Probe auf das Optionsfeld für dieProbe in der Spalte mit der Probenpumpe. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen neben den Einstellungen für die Durchflussmenge aus Methode verwenden in der Probeninjektion mit der Systempumpe aktiviert ist.
- Ändern Sie den Wert neben dem Volumenfeld auf der rechten Seite des Bildschirms auf 100 ml. Klicken Sie neben dem Schema für die Bruchsammlung auf die Schaltfläche Aktivieren. Deaktivieren Sie das Feld Fraktionsgröße verwenden in den Methodeneinstellungen, und ändern Sie dann die Fraktionsgröße in 4 ml.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche für die erste Spaltenwäsche (Wäsche 1). Die in der Tabelle aufgeführten Werte sollten "Anfangspuffer B" 4 %, "Endpuffer B" 4 % und "Volumen (CV)" 10 sein. Klicken Sie neben dem Schema für die Sammlung von Fraktionen auf das Feld Aktivieren. Deaktivieren Sie die Option Fraktionsgröße in den Methodeneinstellungen verwenden, und ändern Sie dann die Fraktionsgröße in 4 ml.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche für die zweite Spaltenwäsche (Wäsche 2). Die in der Tabelle aufgeführten Werte sollten "Anfangspuffer B" 0 %, "Endpuffer B" 0 % und "Volumen (CV)" 5 sein. Klicken Sie neben dem Schema für die Sammlung von Fraktionen auf das Feld Aktivieren. Deaktivieren Sie die Option Fraktionsgröße in den Methodeneinstellungen verwenden, und ändern Sie dann die Fraktionsgröße in 4 ml.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche für die dritte Spaltenwäsche (Wäsche 3). Die in der Tabelle aufgeführten Werte sollten "Anfangspuffer B" 0 %, "Endpuffer B" 0 % und "Volumen (CV)" 5 sein. Klicken Sie neben dem Schema für die Sammlung von Fraktionen auf Aktivieren. Deaktivieren Sie das Feld Fraktionsgröße verwenden in den Methodeneinstellungen, und ändern Sie dann die Fraktionsgröße in 4 ml.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Elution. Klicken Sie in der rechten Tabelle auf die aufgelisteten Informationen und klicken Sie im angezeigten Menü auf den Schritt Löschen. Ziehen Sie die Schaltfläche für den isokratischen Farbverlauf zweimal auf die Tabelle, sodass zwei Einträge vorhanden sind.
- Der Wert für den ersten Eintrag sollte lauten: "Anfangspuffer B" 30 %, "Endpuffer B" 30 % und "Volumen (CV)" 10. Der Wert für den zweiten Eintrag sollte lauten: "Anfangspuffer B" 100 %, "Endpuffer B" 100 % und "Volumen (CV)" 10. Klicken Sie neben dem Schema für die Bruchsammlung auf die Schaltfläche Aktivieren. Klicken Sie auf das Kästchen neben Bruchgröße aus Methodeneinstellungen verwenden.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern oben in der Software. Nennen Sie die Datei "purification". Der Schlauch der Pumpe A des FPLC sollte in den Imidazol-freien Waschpuffer gelegt werden, während der Schlauch der Pumpe B in den 500 mM Imidazol-Puffer gelegt werden sollte. Der Probenpumpenschlauch sollte in die 100-ml-Probe eingeführt werden.
- Führen Sie das Programm "Reinigung" durch und warten Sie auf den Zeitpunkt, an dem das 60%ige Isopropanol benötigt wird (Waschgang 2). Halten Sie das Programm an. Pumpe A Schlauch aus der Imidazol-freien Waschanlage in die 60%ige Isopropanol-Waschanlage verschieben. Starten Sie das Programm neu.
- Sobald der Isopropanol-Schritt abgeschlossen ist, unterbrechen Sie das Programm erneut und pumpen Sie den A-Schlauch zurück in den Imidazol-freien Waschpuffer. Starten Sie das Reinigungsprogramm neu (der Rest des Laufs wird automatisiert).
