Aufreinigung von selbstorganisierenden Protein-Nanopartikeln mittels Affinitätschromatographie

Abstract

Quelle: Karch, C. P. et al., Produktion von E. coli-exprimierten selbstorganisierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimere Epitoppräsentation erfordern.J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Aufreinigung von Histidin-markierten selbstorganisierten Protein-Nanopartikeln oder SAPNs mittels Affinitätsflüssigkeitschromatographie. Die daraus resultierenden gereinigten SAPN-Fraktionen eignen sich für die Impfstoffentwicklung und sind vielversprechend für potenzielle immuntherapeutische Anwendungen.

Protocol

>1. Expression des selbstorganisierenden Protein-Nanopartikel-Kerns, der ein Sechs-Helix-Bündel (SHB-SAPN) Protein enthält, in E. coli BL21(DE3)

1. Mischen Sie 95 mL der Komponente A und 5 mL der Komponente B des Mediums in einem 2 l sterilen Erlenmeyerkolben aus Glas gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Fügen Sie Ampicillin bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml hinzu.
2. Beimpfen Sie das Medium mit E. coli aus einer zuvor etablierten Glycerin-Stammkultur. Inkubieren Sie die Kultur bei 30 °C und schütteln Sie sie bei 200 Umdrehungen pro Minute (U/min) für 48 h.
   

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Fischer	BP26181	4 L
ampicillin	Fischer	Artikel-Nr.: BP1760-25	ca. 25 g
Corning Einweg-Vakuumfilter-/Aufbewahrungssysteme	Fischer	Tel.: 09-761-108	Eine Vielzahl von Größen
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Vorgepackte Säulen	GE HealthCare	Tel.: 45-000-325	5er Pack
Glycerin	Fischer	Nr. BP229-4	4 L
Imidazol	Fischer	Nr. O3196-500	500 g
Magic Media E. coli Expressionsmedium	ThermoFisher	Nr. K6803	1 L
MilliporeSigma Millex Sterile Spritze 0,22 mm Filter	Millipore	SLGV033RB	250er Pack
One Shot BL21 Star (DE3) Chemisch kompetente E. coli	ThermoFisher	C601003	20 Fläschchen
Natriumphosphat monobasisch	Fischer	Nr. BP329-500	500 g
Tris Basis	Fischer	Nr. BP152-1	ca. 1 kg
Harnstoff	Fischer	Nr. BP169-500	2,5 kg
Ausrüstung
Fiberlite F14-14 x 50cy Bremsscheibe mit festem Winkel	ThermoFisher	Tel.: 096-145075	Rotor
NGC Quest 10 Chromatographie-System	BioRad	7880001	FPLC zur Unterstützung der Proteinreinigung
Sonifer 450	Branson	Auch bekannt als 096-145075	Ultraschallgerät