Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt. Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Konstruktion von humanisierten Mäusen, die mit einem chimären CD4-Antigenrezeptor entwickelt wurden
- Aufbereitung des fetalen Thymus und Isolierung von CD34+ HSCs aus der fetalen Leber
- Verarbeitung von Thymus
- Waschen Sie den Thymus vorsichtig in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Wiederholen Sie den Waschschritt 3 - 4 Mal.
- Fügen Sie 7 ml Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10 % fötales Rinderserum (FBS) + Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptokokken) hinzu. Alles in eine sterile 100 mm Petrischale umfüllen.
- Schneiden Sie den Thymus mit Skalpellen in kleine Stücke von ca. 1 mm2. Legen Sie jedes einzelne Thymusstück in einer einzigen Vertiefung auf eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie eine gebogene stumpfe Pinzette, wenn Sie Thymusstücke auf die 96-Well-Platte übertragen.
- Geben Sie eine kleine Menge Medium (100 - 200 μl) in alle Vertiefungen, damit das Gewebe nicht austrocknet. Unter dem Mikroskop visualisieren (Thymiis haben Lappen und sollten wie Zellsäcke aussehen).
Anmerkung: Entsorge alle Teile, die in irgendeiner Weise fragwürdig aussehen; Oft ist Bindegewebe vorhanden, das nicht implantiert werden sollte.
- Entfernen Sie die bestätigten Thymusstücke und geben Sie sie alle in einen T25-Zellkulturkolben. 7 ml RPMI-Medien, ergänzt mit 10 % FBS und 450 μg/ml Piperacillin/Tazobactam und Amphotericin B, zugeben. Kolben vorsichtig zum Mischen schütteln. Den Kolben über Nacht bei 37 ºC/5 % CO2,
Anmerkung: Dieser Schritt ist erforderlich, um eine bakterielle Kontamination des Gewebes zu verhindern.
- (Optionaler Schritt) Frieren Sie den Thymus für die zukünftige Verwendung ein. Äquilibrieren Sie die Brocken in 90% Human AB Serum mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) für 10 min. Frieren Sie sie bei 1 ºC/min bis -50 ºC ein und kühlen Sie sie dann schnell auf -150 ºC ab. Wenn Sie zum Auftauen bereit sind, tauen Sie schnell in einem 37 ºC warmen Wasserbad auf und waschen Sie es vorsichtig 3x in RPMI-Komplettmedien ohne DMSO.
- Verarbeitung von Leber
- Waschen Sie die Leber vorsichtig in PBS in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Wiederholen Sie den Waschschritt 3 - 4 Mal.
- Geben Sie 10 ml Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) in das konische 50-ml-Röhrchen. Alles in eine sterile 100 mm Petrischale umfüllen.
- Homogenisieren Sie das Lebergewebe mit zwei Skalpellen. Schneiden Sie die Leber in kleine Stücke von ca. 3 mm2. Weißes Bindegewebe ausschneiden und entsorgen.
- Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze, die mit einer stumpfen 16-Gauge-Nadel versehen ist, um die Leberstücke und das Medium aufzunehmen. Dann in ein konisches 50-ml-Röhrchen umfüllen.
- Resuspendieren Sie das Medium und die Gewebesuspension und stoßen Sie es 5-7 Mal aus, um das Gewebe vollständig zu homogenisieren.
- Bereiten Sie 10 ml IMDM-Medien vor, die mit Enzymen ergänzt sind: 500 U/ml Kollagenase, 2.400 U/ml Hyaluronidase und 300 U/ml DNase sowie 450 μg/ml Piperacillin/Tazobactam und Amphotericin B. Filtrieren Sie das Medium über einen 0,22-μm-Filter und geben Sie das Medium dann zur Lebersuspension.
- Verschließen Sie das konische 50-ml-Röhrchen mit der Lebersuspension und verschließen Sie es fest mit einer selbstschließenden Folie wie Parafilm, um ein Auslaufen zu verhindern. In einem Röhrenrotator im Inkubator bei 37 ºC für 90 min drehen.
- Die verdaute Zellsuspension wird durch ein 100 μm Zellsieb in ein frisches 50 ml Röhrchen filtriert.
Anmerkung: Fügen Sie der Suspension PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 50 ml zu erhöhen. Teilen Sie dies in zwei 50-ml-Röhrchen auf, die jeweils 25 ml Zellsuspension enthalten.
- Unterlegen Sie die Zellen in jedem Röhrchen langsam und vorsichtig mit einem Zentrifugationsmedium mit einer Dichte von 10 ml (z. B. Ficoll). Schleudern Sie bei 1.200 x g für 20 min ohne Bremse. Hinweis: Alle in diesem Protokoll erwähnten Zentrifugationen werden bei Raumtemperatur (25 ºC) durchgeführt.
- Entfernen Sie vorsichtig die Grenzfläche (d. h. den Buffy Coat) von jedem Röhrchen und geben Sie es in zwei separate 50-ml-Röhrchen. Erhöhen Sie das Volumen jedes Röhrchens der Grenzfläche mit PBS auf bis zu 50 ml. Bei 300 x g 7 - 10 min schleudern. Überstand vorsichtig ansaugen.
- Kombinieren Sie die beiden Pellets. Noch dreimal mit 50 ml PBS waschen, die 2 % FBS enthalten. Bei 300 x g jeweils 7 - 10 min schleudern und dabei den Überstand vorsichtig ansaugen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 50 ml RPMI-Medien + 10 % FBS. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, bevor Sie mit der Zellsortierung fortfahren.
- Gemäß dem Protokoll des Herstellers sollten CD34+-Zellen sofort mit einem CD34-Sortierkit (z. B. CD34-Mikrokügelchen) sortiert werden.
Anmerkung: Alternativ können Zellen über Nacht in RPMI-Medien + 10 % FBS bei 1 Million/ml kultiviert werden.
- Speichern Sie sowohl CD34+- als auch CD34-Fraktionen.
Anmerkung: In diesem Schritt können CD34+- und CD34-Zellen mit Bambanker-Gefriermedien oder anderen Gefriermedien eingefroren werden. Frieren Sie 1 ml von 4 - 6 x 10 6 CD34+ Zellen pro Röhrchen ein und frieren Sie 1 ml von 40 - 60 x 106 CD34- Zellen pro Röhrchen ein.
- Transduktion von CD34+-Zellen
- Berechnen Sie die Anzahl der Transduktionsvertiefungen, die für eine 6-Well-Gewebekulturplatte benötigt werden. Eine Vertiefung kann verwendet werden, um bis zu 8 x 106 Zellen zu transduzieren. Für jede Knochenmark-/Leber-/Thymusmaus (BLT) werden 0,5 x 106 CD34+-Zellen zusammen mit CD34-Zellen und Thymus unter der Nierenkapsel implantiert, und 0,5 x 106 CD34+-Zellen werden intravenös injiziert. Die Anzahl der zu verwendenden CD34+-Zellen wird durch die Anzahl der Mäuse (1 Million Zellen pro Maus) bestimmt.
- Beschichten Sie die erforderliche Anzahl von 6-Well-Platten-Wells, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurden, mit 1,25 ml rekombinanter humaner Fibronektinlösung (z. B. Retronectin) (20 μg/ml in PBS) in jedem Well. Decken Sie die Platte ab und lassen Sie sie 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer sauberen Biosicherheitswerkbank stehen.
- Aspirieren Sie Fibronektinlösung aus den Vertiefungen und geben Sie 1,25 ml Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierpuffer (FACS) (PBS mit 4 % FBS) zur Blockierung in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (25 ºC) stehen.
- Aspirieren Sie den FACS-Puffer und waschen Sie die Wells einmal mit PBS.
- Bewahren Sie PBS in den beschichteten Vertiefungen auf, bis die Platte gebrauchsfertig ist. Lagern Sie die Platte über Nacht bei 4 ºC, wenn sie nicht sofort verwendet wird.
- CD34+-Zellen in Infektionsmedium (2 % Humanserumalbumin in Yssels serumfreiem T-Zell-Medium) in mit Fibronektinlösung beschichteten Vertiefungen (~2 x 106 Zellen/ml) abfüllen und 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubieren.
- Verwenden Sie eine Pipette, um lentivirale Vektoren bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) zwischen 2 und 10 in die Vertiefungen zu geben. Vorsichtig mischen und über Nacht bei 37 ºC inkubieren.
Anmerkung: Der Titer des verwendeten Lentivirus-Vektors sollte vorher bestimmt werden.
- Ernten Sie die Zellen am nächsten Tag, indem Sie die Böden der Vertiefungen vorsichtig mit einem Zellschaber abkratzen. Sammeln Sie Zellen und zählen Sie mit einem Hämozytometer.
- Zur Vorbereitung der Zellen für das Implantat werden 0,5 x 106 transduzierte CD34+-Zellen mit 4,5 x 106 CD34-Zellen pro Maus kombiniert und in sterile 1,5-ml-Schraubverschlussröhrchen aliquotiert. Schleudern Sie die Zellen mit 300 x g zum Pellet herunter und aspirieren Sie den Überstand. Schleudern Sie sie erneut bei 300 x g, aspirieren Sie den restlichen Überstand mit einer P10-Pipette und aspirieren Sie sehr vorsichtig. Bewahren Sie die trockenen Pellets während der gesamten Studie auf Eis auf. Anmerkung: Um sicherzustellen, dass die Zellen lebensfähig sind, verwenden Sie die pelletierten Zellen und führen Sie die Operation innerhalb von 2-3 Stunden durch.
- Um die Zellen für die Injektion vorzubereiten, drehen Sie 0,5 x 106 transduzierte CD34+-Zellen pro Maus, um den Überstand zu pelletieren und zu aspirieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl RPMI-Medien pro Maus und bewahren Sie sie auf Eis auf.
- Um die Transduktionseffizienz zu überprüfen, aliquotieren Sie ~1 x 105 nicht transduzierte und transduzierte CD34+-Zellen aus jeder Bedingung und Kultur in 200 μl Zytokinmedium (RPMI-Medien mit 10 % FBS, ergänzt mit 100 ng/ml humanem IL-3, IL-6, SCF) in einer 96-Well-Platte für 5 - 7 Tage bei 37 ºC.
Anmerkung: Die Zellen, die in diesem Schritt verwendet werden, werden nicht für chirurgische Zwecke verwendet, sondern um sicherzustellen, dass die Transduktion erfolgreich ist und der Vektor nicht toxisch für das Überleben und die Erneuerung der Stammzellen ist. Die Transduktionseffizienz kann überprüft werden, indem nach der Genexpression des Vektors (z. B. GFP&CD4) gesucht und durch Durchflusszytometrie analysiert wird.
- Gewebetransplantationen zur Konstruktion gentechnisch veränderter Mäuse
- Am selben Tag vor der Operation wird eine Ganzkörperbestrahlung des NOD durchgeführt. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immungeschwächte Mäuse mit einem Cäsium-137-Bestrahlungsgerät und einer Dosierung von 2,7 Gy (270Rad).
Anmerkung: Die NSG-Mäuse sind stark immungeschwächt. Daher müssen ihre Unterbringung und Wartung den höchsten Gesundheitsstandards entsprechen und von hochqualifiziertem Personal durchgeführt werden.
- Thymusstücke und Medium aus dem Kolben in eine 60-mm-Schale geben. Gießen Sie PBS in eine weitere 60-mm-Schale, die zum Reinigen des Trochars und zum Nasshalten der Niere verwendet wird.
- Kühlen Sie die Pipettenspitzen mit positiver Verdrängerung, indem Sie sie in offene, sterile 1,5-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss auf Eis legen. Bleiben Sie mit den getrockneten Zellpellets und der gallertartigen Proteinmischung wie Matrigel auf Eis.
Anmerkung: Es ist wichtig, das gallertartige Proteingemisch und alle Röhrchen oder Spitzen, die es berühren, kalt zu halten, bis die Implantatnadel geladen ist.
- Betäuben Sie die Mäuse: Wiegen Sie die Mäuse einzeln und notieren Sie die Gewichte; schlagen Sie die Mäuse ins Ohr, um sie zu nummerieren. Injizieren Sie ihnen intraperitoneal 15 μl Ketamin (2,6 mg/ml in Kochsalzlösung)/Xylazin (100 mg/ml in Kochsalzlösung) pro Gramm Körpergewicht). Setzen Sie die Mäuse zurück in den Käfig und warten Sie, bis sie vollständig betäubt sind.
Anmerkung: Überprüfen Sie den Betäubungsgrad der Maus, indem Sie eine Pfote zusammendrücken. Wenn die Maus reflexartig zusammenzuckt, verabreichen Sie 25-50% der ursprünglichen Menge an Ketamin/Xylazin, um die Maus weiter zu betäuben. Warten Sie, bis es nicht reflexartig zusammenzuckt, um die Operation durchzuführen.
- Rasieren Sie mit dem Oster-Scherer die linke Seite jeder Maus von der Hüfte bis zur Schulter zwischen der Mitte des Rückens und dem Bauch. Injizieren Sie subkutan 0,3 ml verdünntes Carprofen (6 mg/kg) in die Schulter oder das Leistendreieck (Beingrube) des Tieres. Geben Sie mit einem Wattestäbchen einen kleinen Tropfen Artificial Tears auf jedes Auge und legen Sie die Maus auf die Seite zurück in den Käfig.
Anmerkung: Beschränken Sie die Operationsvorbereitung auf jeweils einen Käfig (ca. 4 - 5 Mäuse).
- Spülen Sie die Kanüle der 16-Gauge-Krebsimplantatnadel (Trokar) mit PBS. Führen Sie mit einer stumpfen, gebogenen Pinzette ein Stück Thymus aus der 60-mm-Schale in die Öffnung der Kanüle ein, wobei sich der Trokar direkt in der Öffnung befindet, und ziehen Sie dann den Trokar zurück, um das Gewebe in die Kanüle zu aspirieren.
- Mit einer Verdrängerpipette und einer gekühlten Spitze 5 μl kaltes, gallertartiges Proteingemisch mit einem getrockneten Zellpellet (CD34+- und CD34-Gemisch für implantierte Zellen) in das Röhrchen geben und vorsichtig umrühren, um eine Zellsuspension zu erzeugen. Pipettieren Sie nicht auf und ab. Pipettieren Sie das gallertartige Proteingemisch / die Zellsuspension in die Öffnung der Kanüle und ziehen Sie den Trokar langsam zurück, um die Nadel zu laden.
Anmerkung: Es wird empfohlen, einen Helfer zu haben, der die Pipette belädt, während man die Implantatnadel manipuliert.
- Tupfen Sie den rasierten Bereich der Maus mit Povidon-Jod ab und wischen Sie den Bereich anschließend dreimal mit einem Alkoholtupfer ab. Bestimmen Sie den dunkelsten Fleck unter der Haut. Dies zeigt die Lage der Milz an. Die Niere ist ca. 5 mm dorsal zur Milz. Heben Sie die Haut mit einer gebogenen Pinzette an und machen Sie einen 15 mm langen Schnitt mit einer chirurgischen Schere in der Haut parallel zur Milz. Machen Sie dann einen ähnlichen Schnitt in der Peritoneumschicht darunter. Bei Männern sollte die Niere gut sichtbar sein und kann einfach durch Drücken auf den Bauch extrudiert werden. Sie können die Niere mit einem Blutstiller oder einer gebogenen stumpfen Pinzette stützen. Bei Frauen neigen die Eierstöcke dazu, die Niere für eine einfache Entnahme zu blockieren. Nehmen Sie mit einem Hämostatikum den Eierstock auf und legen Sie die Niere vorsichtig frei.
- Mit der Nadelzange zupfen Sie ein winziges Loch am hinteren Ende der Nierenkapsel.
Anmerkung: Verwenden Sie diese nadelbestückte Pinzette nicht für den Umgang mit biologisch gefährlichen Materialien.
- Schieben Sie die Implantatnadel in dieses Loch und entlang der Niere, bis die Öffnung der Kanüle vollständig von der Nierenkapsel bedeckt ist.
- Extrudieren Sie das Gewebe vorsichtig unter der Nierenkapsel und ziehen Sie die Nadel wieder heraus. Die Thymusstücke können klebrig sein, verwenden Sie also eine gebogene Pinzette, um sicherzustellen, dass das Thymusstück nicht mit der Nadel herauskommt.
- Heben Sie das Bauchfell mit der Pinzette an und drücken Sie die Niere vorsichtig mit dem Blutstillstand wieder an ihren Platz. Binden Sie einen doppelt geknoteten Stich in das Bauchfell mit resorbierbaren Nähten 4-0 vicryl. Verwenden Sie zwei gewickelte Autoclips-Clips, um die Haut zu schließen.
- Mischen Sie die transduzierten CD34+-Zellen, die für die Injektion beiseite gelegt sind, und nehmen Sie 100 μl (0,5 x 106 Zellen) in eine Insulinspritze auf. Injizieren Sie diese Zellen durch retroorbitale Veneninjektion oder andere Wege der intravenösen Injektion in die Maus. Geben Sie mit einem Wattestäbchen einen kleinen Tropfen Artificial Tears auf jedes Auge und legen Sie die Maus auf die Seite zurück in einen Käfig.
- Sobald alle Mäuse implantiert sind, vergewissern Sie sich, dass die Tiere wieder zu Bewusstsein kommen und normal gehen, bevor Sie sie verlassen.
- Nachsorge: Am Tag nach der Operation injizieren Sie 0,3 ml verdünntes Carprofen (6 mg/kg) und 1,2 ml sterile Kochsalzlösung subkutan in jede Maus. 2 und 3 Tage nach der Operation injizieren Sie subkutan 1,5 ml sterile Kochsalzlösung in jede Maus. Überwachen Sie die Mäuse und die Schnitte 10-14 Tage nach der Operation. Entfernen Sie die Autoclips und wiegen Sie die Mäuse nach 10-14 Tagen. Anmerkung: Mäuse sind nach der Bestrahlung träge, und die Injektion von Kochsalzlösung verhindert, dass die Tiere dehydrieren.
- Überprüfen Sie nach 8 - 10 Wochen die Transplantation, indem Sie die Mäuse bluten lassen und eine FACS-Analyse des peripheren Blutes durchführen, wobei Sie auf Marker wie CD45, CD3, CD4, CD8 und alle Gene färben, die der Vektor exprimieren sollte.
