Erzeugung von Plasmamembranvesikeln aus Knochenmarkstammzellen

Abstract

Quelle: Xu, L. et al., Vorbereitung von Plasmamembranvesikeln aus mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks für eine mögliche Zytoplasmaersatztherapie.J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Erzeugung von Plasmamembranvesikeln aus Knochenmarkstammzellen, indem sie schnell durch einen Membranfilter geleitet werden. Diese PMVs zeigen Potenzial für eine Zytoplasma-Ersatztherapie.

Protocol

>1. Montage des Gerätes

1. Um die Sterilität zu gewährleisten, schalten Sie vor der Verwendung das ultraviolette (UV) Licht einer Gewebekulturhaube 30 Minuten lang ein.
2. Schrauben Sie eine 25-mm-Einwegfiltereinheit ab und tauchen Sie die Kappe und den Boden des Geräts 30 Minuten lang in einen 200-ml-Glasbecher, der mit 75 % Ethanol gefüllt ist. Das Gerät besteht aus medizinischem Polypropylen.
3. Nehmen Sie die Kappe und den Boden des Geräts mit einer Pinzette auf, schütteln Sie das restliche Ethanol von Hand ab und lassen Sie die Teile 10 Minuten lang in der Haube an der Luft trocknen.
4. Befeuchten Sie eine 19 mm starke Polycarbonat-Membran mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und legen Sie sie vorsichtig auf die Stützmatrix am Boden des Geräts. Die Polymerfolie hat eine glatte, ebene Oberfläche und spurgeätzte 3 μm Poren.
5. Bauen Sie das Gerät wieder zusammen, indem Sie die Kappe fest gegen die Unterseite schrauben. Achten Sie darauf, dass sich die Membran nicht aus der Mitte löst.
6. Entfernen Sie die Nadel einer 1-ml-Insulinspritze und ziehen Sie 1 ml PBS. Befestigen Sie die Spritze an der Filtereinheit und schieben Sie PBS durch die Einheit, um die Baugruppe zu benetzen und zu prüfen, ob ein Leck vorliegt.

>2. Erzeugung von Plasmamembranvesikeln (PMVs)

1. Etablieren Sie eine Kultur der mesenchymalen Stammzelle (BMSC) des Knochenmarks, wie von Nemeth et al. berichtet, in Dulbeccos DMEM-Kulturmedium (Modified Eagle Medium), das 15 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin enthält. Kultivieren Sie die Zellen in einer 6-Well-Platte in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C.
2. Um die Zellen zu vermehren, entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Vertiefung mit 0,5 ml kalziumfreiem PBS.
3. Fügen Sie 0,5 ml 0,25 % Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (Trypsin-EDTA) hinzu und inkubieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei 37 °C. Klopfen Sie die Platte ein paar Mal gegen die Handfläche, um die Zellablösung zu erleichtern. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie 1 ml Nährmedium hinzufügen.
4. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen und drehen Sie sie 2 Minuten lang bei 200 x g in einer Tischzentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen in 4 ml Kulturmedium und aliquotieren Sie die Zellen in zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte.
   Anmerkung: Die Zellen erreichen den Zusammenfluss in der Regel nach etwa 24 Stunden.
5. Um PMVs zu erzeugen, ernten Sie die Zellen aus einer Vertiefung (ca. 5 x 10⁵ Zellen) einer 6-Well-Platte durch Trypsinverdau und monodispergieren Sie die Zellen in 0,5 ml Kulturmedium.
6. Laden Sie die Zellen in die Insulinspritze, befestigen Sie sie an der Filtereinheit und drücken Sie den Kolben schnell, um die Zellen durch den Filter zu drücken. Entsorgen Sie das extrudierte Medium, da sich darin nur wenige PMVs befinden sollten.
7. Laden Sie weitere 0,5 ml Medium in die Spritze und schieben Sie es schnell durch den Filter. Sammelte das Medium der zweiten Extrusion, das PMVs verschiedener Größen enthält.
8. Laden Sie 150 μl des gesammelten Mediums in eine 35-mm-Glasbodenschale und lassen Sie die PMVs etwa 10 Minuten lang auf dem Boden absetzen. Untersuchen Sie die PMVs unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist, unter Verwendung des 20X-Objektivs.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IsoporeTM Membranen	Millipore	TSTP04700	3 mm Pore
Einweg-Filtereinheit	Xinya, Shanghai, China	ca. 25 mm	Polypropylen in medizinischer Qualität
Insulin-Spritze	Bd	328446	1 ml