Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. UV-Mutagenese zur Erzeugung auxotropher Hefestämme
- Erstellung von Überlebenskurven zur Bestimmung der benötigten Dosen von ultravioletter (UV) Strahlung
- Bereiten Sie YPD-Medien (Hefeextrakt, Pepton, Dextrose) und andere in Tabelle 1 aufgeführte Reagenzien gemäß den Standardverfahren vor und inokulieren Sie einzelne Kolonien in 5-10 ml YPD-Medien. Inkubieren Sie die Kulturen auf einer Walzentrommel bei 30 °C O/N mindestens 8 Stunden lang bis zur Sättigung.
- Bestimmen Sie die Zellkonzentration von Overnight-Kulturen (O/N) mit einem Spektralphotometer, indem Sie die Zellen in einer Kunststoffküvette 1:10 in Wasser verdünnen. Die Zellen werden auf eine Konzentration von 107 Zellen/ml in 20 ml sterilem destilliertem Wasser verdünnt.
- Gießen Sie verdünnte Zellen in eine sterile Petrischale aus Kunststoff und stellen Sie die Platte bei abgenommenem Deckel 14 cm unter eine UV-Lampe.
- Setzen Sie die Zellen serieller UV-Bestrahlung von 5.000 μJ und 10.000 μJ aus, wobei nach jedem Inkrement 500 μl Zellen extrahiert werden, so dass die Zellen nach Exposition bei 0 μJ, 5.000 μJ, 10.000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 25.000 μJ, 30.000 μJ, 40.000 μJ entnommen werden. und 50.000 μJ UV-Strahlung. Übertragen Sie extrahierte Zellproben in sterile 1,5-ml-Röhrchen und verdünnen Sie sie seriell in Schritten von 1:10 in sterilem Wasser.
- Pelletzellen in jeder Verdünnung durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 x g für 1 min. Überstand aspirieren und in einem 100 μl Volumen sterilem Wasser resuspendieren, das für die Beschichtung von Hefezellen geeignet ist. Pipettieren Sie das gesamte Volumen der resuspendierten Zellen auf Platten mit YPD-Festmedien und verwenden Sie einen sterilen Spreader, um die Zellen gleichmäßig auf jede Platte zu verteilen.
- Wickeln Sie die Plattenränder mit Parafilm ein, um das Austrocknen des Mediums zu verhindern, und decken Sie die Platten mit Aluminiumfolie ab, um die Photoreaktivierung und die Reparatur von UV-induzierten Mutationen zu verhindern. Inkubieren Sie die Platten kopfüber bei 30 °C für 2-4 Tage, um das Wachstum lebensfähiger Hefekolonien zu ermöglichen (Abbildung 1).
- Zählen Sie die Anzahl der Kolonien, wahlweise mit Hilfe eines Stifts zum Markieren der gezählten Völker, eines tragbaren elektronischen Zählstifts oder eines Gegenständers mit Vergrößerung. Plotten Sie als Prozentsatz der gesamten plattierten Zellen bei jeder μJ-Dosis UV-Bestrahlung, um eine Überlebenskurve für bestrahlte Hefe zu erstellen (Abbildung 2).
HINWEIS: Es ist zu erwarten, dass haploide Hefestämme im Vergleich zu diploiden Hefestämmen niedrigere Dosen von UV-Bestrahlung benötigen, um das gleiche prozentuale Überleben zu erreichen. Ein Hefestamm ohne funktionelle DNA-Reparaturenzyme, wie z. B. die rad1 S. cerevisiae-Mutante, kann als Positivkontrolle verwendet werden, um das Vorhandensein von UV-Bestrahlung bei sehr niedrigen Dosen anzuzeigen.
- Die Dosis der UV-Mutagenese, die für das Screening verwendet werden soll, ist anhand der in Abschnitt 1.1.7 festgelegten Überlebenskurve zu bestimmen. Der x-Wert des Punktes entlang der Überlebenskurve, an dem y gleich 50 ist, ist die UV-Bestrahlungsdosis, bei der 50 % der Hefe überleben. Das Screening von Mutanten bei diesem niedrigen Überlebensprozentsatz kann zu einer höheren Ausbeute an erfolgreich mutierten Stämmen führen, insbesondere bei diploider Hefe. Die 50%ige Überlebensdosis für WT S. boulardii, wie in Abbildung 2 gezeigt, beträgt etwa 18.000 μJ.
HINWEIS: Obwohl solch hohe UV-Dosen das Risiko von Mutationen in Genen für andere zelluläre Signalwege als das interessierende auxotrophe Markergen erhöhen, muss dieser Nachteil gegen die Notwendigkeit abgewogen werden, Mutationen in beiden Kopien des auxotrophen Markergens zu induzieren. Bei haploiden Stämmen, bei denen nur eine Genkopie mutiert sein muss, verringert das Screening mit einem höheren prozentualen Überlebensprozentsatz, z. B. bei 90 %, das Risiko zusätzlicher Mutationen und ermöglicht immer noch eine ausreichende Erzeugung auxotropher Mutanten.
- UV-Mutagenese und Screening auf auxotrophe Hefestämme
- Bereiten Sie die Hefe wie in den Schritten 1.1.1-1.1.3 beschrieben vor.
- Die Hefe wird der Dosis von UV-Strahlung ausgesetzt, die einer Überlebensrate von 50 % entspricht, wie in Abschnitt 1.1.8 bestimmt. Für WT S. boulardii wurde diese Dosis auf etwa 18.000 μJ bestimmt (Abbildung 2).
- 1 ml Volumen UV-bestrahlter Hefe und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 x g für 1 min sammeln. Überstand aspirieren und in 100 μl sterilem Wasser resuspendieren.
- Selektion der Mutanten
- Bei Verwendung von Selektionen, wie z. B. bei Ura3-auxotrophen Mutanten, wird bestrahlte Hefe auf Medien mit 5-Fluororotinsäure (5-FOA) plattiert, um nach Zellen zu selektieren, denen ein funktionelles Ura3-Enzym fehlt.
HINWEIS: Jede Hefe, die funktionelle Kopien von Ura3 enthält, wandelt 5-FOA in das Toxin 5-Fluorouracil um, was zum Zelltod führt und eine einfache Selektion von Ura3-Kolonien ermöglicht, denen ein funktionelles Ura3 fehlt. Analoge Selektionsansätze sind für das LYS2 und LYS5 möglich; TRP1;und MET2- und MET15-Marker unter Verwendung von Medien, die α-Aminoadipinsäure enthalten; 5-Fluoranthranilsäure; bzw. Methylquecksilber.
- Pipettieren Sie die 100 μl resuspendierten Zellen auf ein minimales Medium mit 5-FOA und verwenden Sie einen sterilen Spreader, um die Platte gleichmäßig zu beschichten. Wickeln Sie die Platten in Parafilm ein und inkubieren Sie kopfüber bei 30 °C für 2-4 Tage, um das Wachstum lebensfähiger Hefekolonien zu ermöglichen.
- Der ura3-Phänotyp einer Kolonie, die auf 5-FOA-Platten erscheint, wird durch Auffrischung auf YPD-, Uracil- und 5-FOA-Platten bestätigt (Abbildung 3). Verwenden Sie die Spitze eines sterilen Zahnstochers, um einen Teil einer einzelnen Kolonie zu sammeln, und ziehen Sie die Zellen vorsichtig über frische YPD-, Uracil- und 5-FOA-Platten. Auch hier die eingewickelten Platten kopfüber bei 30 °C für 2-4 Tage inkubieren.
HINWEIS: Lebensfähige Kolonien erscheinen als erhabene, etwa kreisförmige Wucherungen, während nicht lebensfähige Zellen nur als undurchsichtiger Abstrich ohne erhabene Wucherungen erscheinen (Abbildung 3).
- Screening von Mutanten
- Wenn eine auxotrophe Mutante erzeugt wird, für die keine Selektionsmethoden verfügbar sind, bereiten Sie serielle 1:10-Verdünnungen von UV-bestrahlten Hefezellen in sterilem Wasser vor und pipettieren Sie die Verdünnungen auf YPD-Medien, wobei Sie einen sterilen Spreader verwenden, um die Platte gleichmäßig zu beschichten.
- Wickeln Sie die Platten in Parafilm ein und inkubieren Sie kopfüber bei 30 °C für 2-4 Tage. Bestimmen Sie, welche Verdünnung das Wachstum einzelner Kolonien ermöglichte, die leicht voneinander unterschieden werden können, in der Regel nicht mehr als etwa 100 Völker pro Platte.
- Die UV-Mutagenese von Hefeproben wie in 1.2.1-1.2.3 beschrieben und von Plattenzellen in dieser bestimmten Verdünnung wiederholen. Pipettieren Sie die verdünnte Hefe auf YPD-Medien, verteilen Sie die Zellen mit einem sterilen Spreader und inkubieren Sie die eingewickelten Platten kopfüber bei 30 °C für 2-4 Tage.
- Screening auf Auxotrophe durch Replikation der Beschichtung auf selektiven Medien, denen der interessierende Metabolit fehlt. Befestigen Sie zunächst ein steriles Samtpad auf einem Plattenständer und drehen Sie die Platte mit UV-bestrahlten Kolonien auf den Samt um, um die Ausrichtung der Platte zu markieren.
- Als nächstes drehen Sie eine frische Platte, der der gewünschte Metabolit fehlt, auf den Samt um und drücken Sie sie leicht nach unten, um Zellen vom Samt auf die Platte zu übertragen. Lagern Sie die Originalplatte bei 4 °C. Wickeln Sie die neue Platte ein und inkubieren Sie sie kopfüber bei 30 °C für 2-4 Tage.
- Als Alternative zur Replikationsbeschichtung können Mutanten gescreent werden, indem Kolonien von YPD auf selektive Medien erneut gestreift werden. Verwenden Sie die Spitze eines sterilen Zahnstochers, um einen Teil einer einzelnen Kolonie zu sammeln, und ziehen Sie die Zellen vorsichtig über eine frische YPD-Platte und eine Platte, in der der gewünschte Metabolit fehlt. Die eingewickelten Platten erneut kopfüber bei 30 °C für 2-4 Tage inkubieren.
HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, einzelne Kolonien auszuwählen und Kolonien mehrmals zu streichen, um eine homogene Population echter auxotropher Zellen zu bestätigen.
- Des Weiteren wird der Phänotyp bestrahlter Zellen bestätigt, indem einzelne Kolonien in 5-10 ml YPD und Medien ohne den entsprechenden Metaboliten inokuliert werden (z. B. in Uracil-Medien für eine ura3-Mutante). Auf einer Walzentrommel bei 30 °C O/N inkubieren, um das Wachstum der Zellen in YPD-Medien zu bestätigen, jedoch nicht in Abwesenheit des Metaboliten.
HINWEIS: Obwohl die Wachstumsmuster auf festen Medien eindeutig auf den auxotrophen Status der Hefe hinweisen sollten, ist es möglich, dass einige Hefen Stress tolerieren und kleine, langsam wachsende Kolonien auf festen Medien bilden, aber dennoch nicht die gleichen Bedingungen in flüssigen Medien tolerieren (unveröffentlichte Beobachtungen). Die Inokulation in Flüssigkulturen sollte daher durchgeführt werden, um die Wachstumsmuster von UV-bestrahlten Mutanten gründlich zu bestätigen.
- Für die Langzeitlagerung bestätigter auxotropher Mutanten sind die Glycerinbestände durch Inokulation der Zellen in 10 ml YPD und die Inkubation auf einer Walzentrommel O/N bei 30 °C vorzubereiten. Pelletzellen durch Zentrifugation für 3 min bei 2.500 x g und Aspiratmedien. Die Zellen werden in 50 % sterilem gefiltertem Glycerin resuspendiert, in ein Kryofläschchen überführt und bei -80 °C gelagert.
HINWEIS: UV-mutagenisierte Hefe enthält möglicherweise Mutationen in mehreren Genen, die nicht in dem interessierenden auxotrophen Marker enthalten sind. Bevor mit der Verwendung verifizierter auxotropher Mutanten fortgefahren wird, sollten diese Stämme durch Gensequenzierung und Bewertung der Resistenz gegen pH-Wert, Gallensäurestress und andere für probiotische Stämme relevante Merkmale, wie an anderer Stellebeschrieben 2, weiter analysiert werden. Darüber hinaus sollte die Verwendung von PCR-Homologie oder CRISPR/Cas9-Targeting zur selektiveren Mutation auxotropher Marker als Alternative zur UV-Mutagenese in Betracht gezogen werden.
>2. Hefe-Umwandlung
- LiOAc-Umwandlung von Hefe
- Einzelne Hefekolonien in 5-10 ml YPD-Medien impfen und auf einer Walzentrommel bei 30°C O/N inkubieren.
- Um das Wachstum der logarithmischen Phase zu induzieren und die Effizienz der Plasmidaufnahme zu erhöhen, bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Spektralphotometer, um eine Verdünnung der Zellen im Verhältnis 1:10 in sterilem Wasser in einer Kunststoffküvette zu messen. Verdünnen Sie O/N-Kulturen auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,16-0,2 (ca. 2 x 10 6-2,5 x 106 Zellen/ml) in 50 ml frischem, warmem YPD und inkubieren Sie die Zellen auf einem orbitalen Plattformschüttler mit 200 U/min, bis die Kultur etwa 1 x 107 Zellen/ml erreicht. In der Regel ca. 4 Std. < />
HINWEIS: Die Transformationseffizienz kann in Abhängigkeit von der Anzahl der erfolgreich transformierten Hefekolonie-bildenden Einheiten (KBE) pro μg Plasmid-DNA gemessen werden. Die erhöhte Effizienz führt zu mehr transformierten Kolonien pro μg Plasmid-DNA. Die Subkultivierung von Hefezellen und die Entnahme während des Wachstums in der logarithmischen Phase ist ein Faktor, der die Transformationseffizienz erhöht.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 2.500 x g für 3 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, indem Sie das Pellet in 1 ml sterilem Wasser resuspendieren.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 1 min in einer Mikrozentrifuge, Aspiration des Überstands und Waschen der Zellen durch Resuspension in 1 ml TE/LiOAc (Tris EDTA/Lithiumacetat) Puffer.
- Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in TE/LiOAc-Puffer auf eine Konzentration von 2 x 109 Zellen/ml.
- Bereiten Sie Transformationsmischungen mit jedem der folgenden Elemente vor: 50 μl zubereitete Hefe in TE/LiOAc-Puffer, 5 μl Träger-DNA (10 μg/μl) und 1 μl Plasmid-DNA (1 μg). Mikrogramm Plasmid-DNA können titriert werden, da zunehmende DNA-Mengen zu einer erhöhten Transformationseffizienz führen können oder auch nicht.
HINWEIS: Bei einem mutierten Hefestamm, dem ein auxotropher Marker fehlt, kann pro Probe nur ein Plasmid, das für den Marker kodiert, transformiert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Plasmids, das für ein leicht nachweisbares Protein, wie z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP), kodiert, eine effiziente Bestimmung der korrekten Faltung und Expression des heterologen Proteins durch den Hefestamm nach der Transformation.
- Zu jedem Präparat 300 μl PEG/LiOAc/TE zugeben und gründlich vortexen. Die Inkubation intakter Zellen mit Polyethylenglykol (PEG) ist für eine effiziente Transformation unerlässlich.
Die - Präparate werden 30 Minuten lang bei 30 °C unter Rühren inkubiert, indem die Mikrozentrifugenröhrchen in ein Becherglas gegeben werden, das bei 200 U/min auf einen Orbitalplattformschüttler gestellt wird.
- Geben Sie 35 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) zu jeder Reaktion und erhitzen Sie die Zellen 15 Minuten lang in einem 42 °C warmen Wasserbad. Obwohl es widersprüchliche Berichte über den zusätzlichen Nutzen von DMSO gibt, hat sich gezeigt, dass der Hitzeschock intakter Hefezellen die Transformationseffizienz stark erhöht.
- Die Zellen werden durch Pelletieren durch Zentrifugation wie in Nummer 2.1.5 gewaschen, der Überstand abgesaugt oder pipettiert und in 1 ml sterilem Wasser resuspendiert. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um das Küvettenpellet aufzubrechen.
HINWEIS: Es ist wichtig, den Überstand gründlich zu entfernen, da das Medium, das zur Erzeugung kompetenter Zellen verwendet wird, das Hefewachstum und die Koloniebildung hemmen kann.
- Die Zellpelletierung wie in 2.1.5 wiederholen, den Überstand aspirieren und die Zellen in 100 μl sterilem Wasser resuspendieren. Pipettieren Sie das gesamte Volumen auf eine selektive Platte und verwenden Sie einen sterilen Spreader, um die Platte gleichmäßig mit transformierter Hefe zu beschichten.
- Wickeln Sie die Kanten der beschichteten Platten in Parafilm ein, um ein Austrocknen des Mediums zu verhindern, und inkubieren Sie es kopfüber bei 30 °C für 2 Tage, um das Wachstum der transformierten Hefezellen zu ermöglichen. Eine erfolgreiche, effiziente Transformation und auxotrophe Selektion von Saccharomyces cerevisiae führt zu einer hohen Anzahl von Kolonien pro Transformationspräparat, obwohl die Ausbeute bei anderen Stämmen deutlich geringer sein kann (Abbildung 4).
- Hefeplatten kurzfristig (in der Regel 1-3 Wochen) kopfüber und abgedeckt bei 4 °C lagern. Glycerinvorräte an transformierter Hefe wie in 1.2.5 beschrieben für die Langzeitlagerung vorbereiten.
HINWEIS: Weitere Studien zur Untersuchung der transformierten KBE sind erforderlich, um die Plasmidstabilität zu bestimmen und die korrekte Expression des heterologen Proteins zu bewerten. Ausführliche Beschreibungen der Plasmidstabilität, der Verwendung von Immunblotting zum Nachweis denaturierter Proteine, die aus Zellproben gewonnen wurden, des Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) zum Nachweis ordnungsgemäß gefalteter dreidimensionaler Proteine und der Verwendung von GFP in Hefestudien sind an anderer Stelle verfügbar. Abbildung 5 zeigt ein repräsentatives Bild der erfolgreichen GFP-Expression in transformierten S. cerevisiaerelativ zu nicht transformierten Zellen. Die Verwendung eines solchen fluoreszierenden Proteins ist ein Mittel, um die erfolgreiche Produktion heterologer Proteine effizient zu bestimmen.
- Elektroporation von Hefe
- Einzelne Hefekolonien in 5-10 ml YPD-Medien impfen und auf einer Walzentrommel bei 30 °C O/N inkubieren.
- Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Spektralphotometer, um eine Verdünnung der Zellen im Verhältnis 1:10 in sterilem Wasser zu messen. Verdünnen Sie O/N-Kulturen in 100 ml frischem, warmem YPD-Medium auf ein OD600-Äquivalent von ca. 0,3. Inkubieren Sie Subkulturen bei 30 °C auf einem orbitalen Plattformschüttler, der auf 200 U/min eingestellt ist, bis ein OD600 von etwa 1,6 erreicht ist, normalerweise 4-5 Stunden. Jede 100-ml-Subkultur erzeugt genügend konditionierte Zellen für zwei Transformationsreaktionen.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 2.500 x g für 3 min. Den Überstand aspirieren und die Zellen durch Resuspendieren in 50 ml eiskaltem, sterilem Wasser waschen. Wiederholen Sie den Waschvorgang, indem Sie die Zellen pelletieren, den Überstand absaugen und in frischem 50 ml eiskaltem, sterilem Wasser resuspendieren.
- Die Zellen wieder pelletieren und in 50 ml eiskaltem Elektroporationspuffer (1 M Sorbitol, 1 mM Calciumchlorid (CaCl2)) resuspendieren.
- Wiederholen Sie das Spin wie in 2.2.3, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 20 ml 0,1 M LiOAc/10 mM Dithiothreitol (DTT). Die Zellsuspension auf einer Walzentrommel bei 30 °C für 30 min inkubieren. Die Vorinkubation von Zellen in LiOAc und DTT erhöht synergetisch die Effizienz der Elektroporation.
- Die Zellen werden wie in 2.2.3 pelletiert, der Überstand entfernt und durch Resuspendieren in 50 ml eiskaltem Elektroporationspuffer gewaschen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in eiskaltem Elektroporationspuffer auf ein Endvolumen von 1 ml.
- Bereiten Sie auf Eis zu: konditionierte Hefezellen, sterile Elektroporationsküvetten und Plasmid-DNA. Unmittelbar nach der endgültigen Resuspension der konditionierten Zellen in 1 ml Elektroporationspuffer werden 400 μl konditionierte Hefezellen mit ca. 1 μg Plasmid-DNA kombiniert und in eine eiskalte 0,2 μm Elektroporationsküvette gegeben. Die Verwendung erhöhter DNA-Mengen kann die Transformationseffizienz leicht erhöhen. Inkubieren Sie die Reaktion 5 Minuten lang auf Eis, dann elektroporieren Sie mit einem Elektroporator, der auf 2,5 kV und 25 μF eingestellt ist.
HINWEIS: Wie in 2.1.7 beschrieben, kann ein mutierter Hefestamm, dem ein auxotropher Marker fehlt, mit nur einem Plasmid, das für den mutierten Marker kodiert, pro Probe transformiert werden. Die Verwendung eines Plasmids, das für ein leicht nachweisbares Protein wie GFP kodiert, ermöglicht auch eine effiziente Bestimmung der korrekten Faltung und Expression des heterologen Proteins nach der Transformation.
- Elektroporierte Zellen werden in 8 ml einer 1:1-Mischung aus YPD:1 M-Sorbit überführt und die Zellen auf einer Walzentrommel bei 30 °C 60 Minuten lang inkubieren lassen.
- Pelletzellen wie in 2.2.3 und resuspendieren in 100 μl 1:1 YPD:1 M Sorbit. Das gesamte Volumen auf selektive Medien mit 1 M Sorbit auffüllen, die Ränder der Platten mit Parafilm umwickeln und die Platten kopfüber bei 30 °C für 2-5 Tage inkubieren, um das Wachstum der transformierten Hefezellen zu ermöglichen.
ANMERKUNG: Es ist wichtig, transformierte Hefe zu testen, um die korrekte Expression des heterologen Proteins zu bewerten, wie in 2.1.14 und 2.2.7 beschrieben.
- Orale Sonde von Mäusen mit transformierter Hefe
- Führen Sie alle Verfahren zur Tierpflege und -handhabung gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und der Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee durch.
- Bereiten Sie O/N-Hefekulturen vor, indem Sie einzelne Kolonien transformierter auxotropher Hefe in 5-10 ml selektive Medien impfen. Kulturen O/N mindestens 8 Stunden lang auf einer Walzentrommel bei 30 °C inkubieren, bis sie gesättigt sind.
ANMERKUNG: Die Verwendung von Plasmid-kodierenden Testproteinen wie GFP ermöglicht eine einfache Proteinexpressionsprüfung in der Magenhefe, wie in 4.7 beschrieben.
- Für eine maximale Induktion der Proteinexpression und zur Induktion des logarithmischen Phasenwachstums werden Subkulturen aus den O/N-Kulturen hergestellt, indem sie in 50 ml geeigneter Medien auf ein OD600-Äquivalent von etwa 0,16 bis 0,2 verdünnt werden, wie in 2.1.2 beschrieben.
- Die Konzentration der subkultivierten Zellen wird wie in Nummer 1.1.2 bestimmt und auf 109 Zellen/ml eingestellt. Für jede Maus ist eine Dosis von 100 μl und ein zusätzliches Volumen von einigen hundert μl pro Gruppe zu erstellen, um die Genauigkeit und die Beladung der Probe zu verbessern.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 2.500 x g für 3 min oder in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 x g für 1 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie ein gleiches Volumen sterilen Wassers hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren.
- Befestigen Sie eine Sondennadel mit geeigneter Stärke (22 G für 15-20 g Mäuse) auf einer sterilen 1-ml-Spritze und laden Sie die Hefeprobe, wobei Sie darauf achten sollten, dass alle Blasen entfernt werden, und stellen Sie den Kolben auf eine Schrittweite von 100 μl ein. Laden Sie eine zusätzliche Spritze mit sterilem Wasser, um die Kontrollmäuse zu sondieren und auf kontaminierende Hefen zu prüfen.
- Nehmen Sie die zu öffnende Maus mit der nicht dominanten Hand in die Hand, wobei Zeigefinger und Daumen die Haut um den Hals fest umklammern (Abbildung 5A). Stecken Sie den Schwanz unter den kleinen Finger, um eine Bewegung des Unterkörpers zu verhindern. Vergewissern Sie sich, dass der Griff fest sitzt und die Maus nicht den Kopf bewegen kann, um Schäden am inneren Gewebe während der Sonde zu vermeiden.
HINWEIS: Schätzen Sie, wie weit die Sondennadel eingeführt werden sollte, indem Sie die Nadel so gegen die Maus halten, dass sich der Bulbus auf einer Höhe mit dem Xiphoid-Prozess des Brustbeins befindet. Das Einführen dieser Länge der Nadel ermöglicht es der Sondennadel normalerweise, in den Magen einzudringen.
- Führen Sie die Sondennadel mit der dominanten Hand vorsichtig in die Speiseröhre der Maus ein, indem Sie die Nadel entlang des Gaumens und des Rachens anwinkeln und dabei leicht links von der Mitte halten. Warten Sie, bis die Maus den Nadelknollen verschluckt hat, und lassen Sie die Nadel etwas weiter bis zu dem in 3.7 geschätzten Punkt absinken (Abbildung 5B). Wenn während des Einführens der Sondennadel ein Widerstand zu spüren ist oder wenn die Maus zu irgendeinem Zeitpunkt nach Luft zu schnappen beginnt, entfernen Sie die Nadel vorsichtig und versuchen Sie erneut, die Speiseröhre zu finden.
- Nachdem die Maus den Knollen der Sondennadel verschluckt hat, drücken Sie vorsichtig auf den Spritzenkolben, um 100 μl (108 KBE) Hefe direkt in den Magen der Maus zu verabreichen.
HINWEIS: Obwohl Mäuse nach der Verabreichung keine der Sondenlösung erbrechen können, ist es möglich, dass während der Sonde ein Reflux auftritt. Das richtige Einführen der Sondennadel sowie die Anpassung des Volumens und der Viskosität der Lösung können dazu beitragen, den Reflux zu begrenzen und eine genaue Dosierung zu gewährleisten.
- Entfernen Sie vorsichtig die Sondennadel aus dem Magen und der Speiseröhre der Maus und setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein. Überprüfen Sie, ob die Maus nach der Sonde normal atmet und sich bewegt, um sicherzustellen, dass die Sondennadel während des gesamten Eingriffs richtig eingeführt wurde und dass keine Lösung abgesaugt wurde.
Tabelle 1. Liste der Reagenzien. Beschrieben werden die Reagenzien, die für die Herstellung der einzelnen Lösungen benötigt werden, Hefemedien und -platten sowie die Transformationspuffer, die für die Protokolle in diesem Manuskript verwendet werden.
:
:
| Lösungen | Hefemedien und -platten | Reagenzien für die Transformation |
| Polyethylenglykol (PEG) 50%: | YPD: | TE/LiOAc: |
| 250 g PEG 3350 | 20 g Pepton | 50 ml 10x TE |
| 500 ml steriles Wasser | 20 g Traubenzucker | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| Filter sterilisiert | 10 g Hefe-Extrakt | 400 ml steriles Wasser |
| 1 L Wasser | Filter sterilisiert |
| Autoklav | |
| TE 10x: | YPD-Platten: | PEG/TE/LiOAc: |
| 100 mM Tris | 20 g Pepton | 400 ml 50% PEG |
| 10 mM EDTA | 20 g Traubenzucker | 50 ml 10x TE |
| pH bis 7,5 und Filter sterilisieren | 20 g Agar | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| 10 g Hefe-Extrakt | |
| 1 L Wasser | |
| Autoklav | |
| 20% Glukose: | Uracil-selektive Medien | Träger-DNA (SS-DNA): |
| 200 g Traubenzucker | 2 g Aminosäuremischung ohne Uracil | Bei -20 °C lagern und vor der Verwendung 1-2 min bei 100 °C erhitzen, um die Strähnen zu schmelzen, und auf Eis lagern |
| 1 L Wasser | 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren | |
| Filter sterilisiert | 1 L Wasser | |
| Sterilisieren durch Autoklavieren oder sterile Filterung | |
| Vor Gebrauch 20% Glukose 1:10 zugeben | |
| 50% Glycerin: | Uracil-Platten: | Elektroporations-Puffer: |
| 500 ml Glycerin | In einem 250-ml-Kolben | 1 M Sorbit |
| 500 ml Wasser | 2 g Aminosäuremischung ohne Uracil | 1 mM CaCl2 |
| Autoklav | 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren | Mit destilliertem Wasser auffüllen |
| 150 ml Wasser | Autoklavieren und lagern bei 4 °C |
| In einem 2-Liter-Kolben | |
| 20 g Agar | |
| 750 ml Wasser | |
| Kolben separat autoklavieren, dann mit 100 ml 20% Glukose mischen | |
| Vollständiges IMDM | 5-FOA+ Platten: | LiOAc/DVB-T |
| 500 ml Iscove's Modifizierte Dulbecco's Medien | Autoklav in einem 2-Liter-Kolben: | 0,1 Mio. LiOAc |
| 5 ml Penicillin Streptomycin Glutamin 100x | 20 g Agar | 10 mM DVB-T |
| 500 μl 2-Mercaptoethanol | 750 ml Wasser | |
| 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum | mischen: | |
| 2,5 ml Natriumpyruvat 100 mM | 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren | |
| 2 g Aminosäure-Mix ohne Uracil | |
| 150 ml warmes Wasser | |
| Wenn es abgekühlt ist, fügen Sie Folgendes hinzu: | |
| 0,05 g Uracil Pulver | |
| 1 g 5-FOA | |
| Rühren und filtrieren, sterilisieren | |
| Zur autoklavierten Agarlösung hinzufügen | |
| Mit 100 ml 20% Glukose mischen | |
