Generierung von anti-angiogenen tumorassoziierten Neutrophilen

Zusammenfassung

Quelle: Pylaeva, E., et al. Transfer von manipulierten tumorassoziierten Neutrophilen in tumortragende Mäuse, um ihr angiogenes Potenzial in vivo zu untersuchen. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt einen Assay zur Erzeugung von anti-angiogenen tumorassoziierten Neutrophilen (TANs). Bei der Entnahme eines murinen Melanomtumors, der pro-angiogene TANs enthält, werden die einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert und mit einem Inhibitor der Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase (NAMPT) behandelt, um die Fähigkeit zur Stimulierung der Angiogenese zu verringern.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

HINWEIS: Das Gesamtschema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

>1. Vorbereitung der B16F10-Melanomzelllinie

1. Bereiten Sie Mykoplasmen-negative Zellen vor, die zu einer 90 % konfluenten Monoschicht (ca. 10 x 10⁶ Zellen/T75-Kolben) gezüchtet wurden, in vollständigem Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDMc: IMDM + 10 % fötales Rinderserum (FBS) + 1 % Penicillin-Streptomycin).
2. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). 6 ml einer Zellablösung, die proteolytische und kollagenolytische Enzyme enthält (siehe Materialtabelle), geben und 2 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
3. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die verbleibenden adhärenten Zellen von unten zu mobilisieren. Die Zellsuspension in 15-ml-Röhrchen auffangen und bei 300 x g für 7 min und 20 °C zentrifugieren.
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml PBS. 14 mL PBS zugeben und zentrifugieren (300 x g und 20 °C für 7 min).
5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL PBS.
6. Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie auf eine Konzentration von 3 x 10⁶/ml PBS (für Schritt 2) oder 6 x 10⁶/ml PBS (für Schritt 6) für die Injektion. Halten Sie die Zellen maximal 30 Minuten auf Eis.

2. Allogenes Tumormodell bei Mäusen

1. Verwenden Sie 10 weibliche Ifnar1-/- Mäuse im Alter von 8-12 Wochen, die unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten werden.
   Anmerkung: Weibliche Mäuse sind in einem subkutanen Modell des Tumorwachstums vorzuziehen, da männliche Mäuse aggressiver und damit anfällig für Verletzungen der Tumorstelle sind, was das Tumorwachstum beeinflusst.
2. Rasieren Sie die Haut der Maus an der Flanke mit einem Elektrorasierer und desinfizieren Sie die Haut mit einem mit 70 % Ethanol angefeuchteten Taschentuch.
3. Sammeln Sie die vorbereiteten B16F10-Melanomzellen in einer Konzentration von 3 x 10⁶/ml PBS (siehe Schritt 1) in einer 1 ml-Spritze und einer 0,4 x 19 mm Nadel. Injizieren Sie 100 μl der Suspension subkutan.
   1. Mischen Sie die Zellen vor jeder Injektion gut. Verwenden Sie Nadeln mit einem Durchmesser von nicht weniger als 0,4 mm, um die Tumorzellen nicht zu stören.
4. Setzen Sie bis zu 5 Mäuse in einen Käfig und kontrollieren Sie die Tumorgröße (Länge, Breite und Tiefe) mit einem Messschieber für 14 Tage.
   Anmerkung: Laut Tierverordnung sollte die Tumorgröße einen Durchmesser von 15 mm nicht überschreiten, Mäuse mit größeren oder nekrotischen/offenen Tumoren sollten vorher getötet werden.
5. An Tag 14 werden die Mäuse in der CO_{2 -}Kammer geopfert.
6. Desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol und entfernen Sie Tumore mit Schere und Pinzette in einer sterilen Petrischale. Halten Sie Tumore in einem 50-ml-Röhrchen in vollständigem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin) auf Eis.

>3. TAN-Isolierung

1. Platzieren Sie Tumore in sterile 6-Well-Platten, 5 Tumoren pro Well. Tumore mit einer sterilen Schere in 2-3 mm große Stücke schneiden.
   1. Verdau mit 1 ml Dispase/Kollagenase D/DNase I-Lösung (0,2 mg/0,2 mg/100 mg in 1 ml DMEMc) pro Tumor. Bei 37 °C, 5 % CO₂ in einem feuchten Inkubator inkubieren und mit einer 10-ml-Spritze ohne Nadel alle 15 min 3 Mal mischen.
2. Um unverdaute Fasern zu entfernen, werden die Zellen durch 100-μm-Filter in 15-ml-Röhrchen genetzt (eine Vertiefung pro Filter und Röhrchen). PBS auf 15 mL geben, Zentrifugenröhrchen bei 460 x g, 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
3. Lysieren Sie die Erythrozyten mit einem Lysepuffer (NH₄Cl 150 mM, KHCO₃ 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 °C), indem Sie 1 mL in jedes Röhrchen geben. Gut mischen und die Lösung aus allen Röhrchen in einer mischen. Stoppen Sie die Reaktion nach 2 Minuten mit 11 mL eiskaltem (4 °C) DMEMc.
Bei
4. 460 x g, 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet mit 15 ml kaltem PBS. Bei 460 x g, 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
5. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL PBS. 3 μl Fc-Block-Antikörper (CD16/CD32, Stamm 0,5 mg/ml) zugeben und 15 Minuten auf Eis inkubieren.
6. Fügen Sie Antikörper hinzu: 10 μl Ly6G-Phycoerythrin (Ly6G-PE, Stamm 0,2 mg/ml) und 10 μl CD11b-Allophycocyanin (CD11b-APC, Stamm 0,2 mg/ml). Zugabe von 20 μl 6-Diamidin-2-phenylindol-Viabilinfarbstoff (DAPI, Stamm 5 mg/ml) und Inkubation auf Eis in der Dunkelheit für 30 min.
   Anmerkung: Eine andere Kombination von Viabilitätsfarbstoffen und fluoreszierenden Konjugaten von Antikörpern kann verwendet werden.
7. PBS bis zu 15 mL zugeben, 5 min bei 460 x g, 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen.
8. Das Pellet in DMEMc auf eine Konzentration von ca. 10 x 10⁶/ml resuspendieren und auf Eis halten.
9. CD11b⁺ Ly6G^hi alive (DAPI-negative) Neutrophile mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer sortieren (Gating-Strategie, siehe Abbildung 2).
   Anmerkung: Halten Sie das Röhrchen mit Zellsuspension und das Röhrchen mit DMEMc für sortierte Zellen bei 4 °C. Verwenden Sie folgende optimale Sortiereinstellungen: eine 70 μm Düse, eine Schwellenrate von maximal 22.000 Ereignissen/Sekunde und eine Durchflussrate von 1-3.
10. Überprüfen Sie die Reinheit der sortierten Neutrophilen mit einem Zytometer auf eine empfohlene Reinheit von >95%.
11. Sortierte Neutrophile werden 5 min lang bei 460 x g, 4 °C zentrifugiert und der Überstand entfernt. Resuspendieren Sie die sortierten Zellen in DMEMc auf eine Konzentration von 1 x 10⁶/ml.
    Anmerkung: Die erwartete Anzahl von Neutrophilen in einem 14-Tage-B16F10-Tumor (10 mm Durchmesser) beträgt etwa 3 x 10⁴ Zellen.

>4. NAMPT-Hemmung in TANs in vitro

1. Bereiten Sie die FK866-Brühe (NAMPT-Inhibitor) in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Endkonzentration von 100 mM vor.
2. Die Neutrophilen (Schritt 3.11) wurden in 2 Vertiefungen einer 96-Well-U-Bodenplatte (1,5 x 10,⁵ Neutrophile/Well) sortiert. Geben Sie FK866 in die Interventionsvertiefung (Endkonzentration von 100 nM) und eine gleiche Menge DMEMc mit DMSO in die Kontrollvertiefung. 2 h bei 37 °C, 5 % CO₂ in einem feuchten Inkubator inkubieren.
Bei
3. 460 x g, 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie in 200 μl PBS in jeder Vertiefung. 2 Mal wiederholen.
Bei
4. 460 x g, 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie in kommerziellem Endothelzellwachstumsmedium (ergänzt mit 4 μl/ml Endothelzellwachstumssupplement, 0,1 ng/ml rekombinantem humanem epidermalem Wachstumsfaktor, 1 ng/ml rekombinantem humanem basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 90 μg/ml Heparin und 1 μg/ml Hydrocortison) auf eine Endkonzentration von 0,2 x 106 Zellen/ml (in 0,75 ml) (für Schritt 5) oder in PBS auf die Endkonzentration von 0,6 x 10⁶ Zellen/ml ( in 0,25 mL).

Ergebnisse

Abbildung 1. Die Systematik des Protokolls. Schritt 1. Vorbereitung der B16F10-Melanomzelllinie; 2. Allogenes Tumormodell bei Mäusen; 3. Isolierung von TANs aus den Tumoren; 4. Hemmung von NAMPT in TANs in vitro; 5. Abschätzung der angiogenen Eigenschaften von TANs im Aortenring-Assay; 6. Adoptiver Transfer von behandelten Neutrophilen im allogenen Tumormodell; 7. Überwachung des Tumorwachstums, h...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 ml Tuben	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland	6,25,54,502
50 ml Röhrchen	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Deutschland	227261
5ml / 10ml / 25ml sterile Tipps für die automatische Pipette	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Deutschland	6006180 / 607180 / 760180
6 Well-Zellkulturplatten mit flachem Boden	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland	8.33.920
96 Well Zellkulturplatten mit flachem Boden	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Deutschland	Artikel-Nr.: 655180
96-Well-Zellkulturplatten mit U-Boden	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Deutschland	Artikel-Nr.: 65018
Anti-Maus CD11b	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	553312	Klon M1/70, APC-konjugiert, 0,2mg/mL
Anti-Maus Ly6G	BioLegend, Kalifornien, USA	127608	Klon 1A8, PE-konjugiert, 0,2 mg/ml
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA		Sortierer für Zellen
Schieblehre	Vogel Germany, Kevelaer, Deutschland
Casy-Zellen-Zähler	Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Deutschland
Cell Trics 50μm / 100 μm Sterilfilter	Sysmex Partec GmbH, Görlitz, Deutschland	Tel.: 04-004-2327 / 04-004-2328
Zentrifuge Rotina 420 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Deutschland	Nr. 4706
Kollagenase D	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Deutschland	11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dilactat)	BioLegend, Kalifornien, USA	422801	Lagerbestand: 5mg/ml
Dispase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Deutschland	D4818-2MG
DMEM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	Artikel-Nr.: 41966-029	DMEM komplett: DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin
DMSO (Dimethylsufoxid)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Deutschland	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Deutschland	DN25-100MG
DPBS (Englisch)	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	Tel.: 14190-094
Wachstumsmedium für Endothelzellen	PromoCell, Heidelberg, Deutschland	Nr. C-22010
FBS (Fötales Rinderserum)	Biochrom, Berlin, Deutschland	Nr. S0115
Fc-Block (Anti-Maus CD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	553142	Klon 2.4G2, Bestand: 0,5 mg/ml
FK 866 Hydrochlorid	Axon Medchem, Groningen, Niederlande	Axon 1546	Lagerbestand: 100 mM
Ziege Anti-Kaninchen IgG H&L	Abcam, Cambridge, Großbritannien	Artikel-Nr.: ab97075	Cy3-konjugiert, Bestand: 0,5 mg/mL
Heracell 240i CO2-Inkubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51026334
IMDM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	Artikel-Nr.: 12440-053	IMDM komplett: IMDM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin
Isis GT420 Rasierer	B. Braun Asculap, Suhl, Deutschland	90200714
Matrigel Matrix Basalmembran	Corning Life Sciences, Amsterdam, Niederlande	7205011
Monoklonales Anti-Aktin, α-glatte Muskulatur	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Deutschland	Nr. F3777	FITC-konjugiert, keine Informationen über die Bestandskonzentration
Nadeln 0,4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	Artikel-Nr.: 302200
Neomount	Merck, Darmstadt, Deutschland	HX67590916
Normales Ziegenserum	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA	Tel.: 005-000-121
Penicillin Streptomycin	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	Nr. 15140-122
Pipetus automatische Pipette	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Deutschland	Artikel-Nr.: 9907200
ProLong Gold Antifading-Eindeckmittel mit DAPI	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	Nr. P36935
Kaninchen Anti Maus Laminin gamma 1 Kette	Immundiagnostik, Bensheim, Deutschland	AP1001.1	Keine Informationen über die Bestandskonzentration
StemPro Accutase	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	Nr. A1105-01
Skalpell zur sterilen Entsorgung (Nr. 15)	MedWare, Neapel, USA	Artikel-Nr.: 120920
Spritzen 1 ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	303172
Spritzen 10 ml	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	Artikel-Nr.: 309110
T75 sterile Zellkulturflaschen	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland	83,39,11,302

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