Eine Avidin-Biotin-Konjugationstechnik zur Präsentation von Zielantigenen auf Mycobacterium bovis BCG

Zusammenfassung

Quelle: Liao, T. A., et al., Expression von exogenen Antigenen im BCG-Impfstoff von Mycobacterium bovis über nicht-genetische Oberflächendekoration mit dem Avidin-Biotin-System. J. Vis. Exp. (2018).

Das Video zeigt eine Technik zum Laden von Antigenen auf Mycobacterium bovis BCG, um seine immunogenen Eigenschaften zu verbessern. Das Verfahren nutzt das Avidin-Biotin-System, um die Bakterienoberfläche mit exogenen Antigenen zu beschichten.

Protokoll

>1. Biotinylierung der BCG-Zelloberfläche

1. BCG in Middlebrook 7H9 Bouillon mit 10 % OADC (Ölsäure, Albumin und Dextroselösung) und 0,05 % Tween 80 bei 37 °C auf einer Shaker-Plattform bei 50 U/min anbauen, bis OD = 0,5-1,
   HINWEIS: BCG ist ein Erreger der Biosicherheitsstufe 2 und alle Experimente, die BCG betreffen, sollten in einer Biosicherheitswerkbank mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
2. 10⁹ BCG 3-mal mit 500 μl eiskaltem, endotoxinfreiem PBS plus 0,1 % Tween80 (PBST) (pH 8,0) waschen. Suspendieren Sie das BCG-Pellet in sterilem, endotoxinfreiem PBS.
3. Bereiten Sie unmittelbar vor Gebrauch 1 ml 10 mM Sulfo-NHS SS Biotin in steril gefiltertem Wasser vor.​
   1. Inkubieren Sie Bakterien mit 1 ml 0,5 mM Sulfo-NHS SS Biotin bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
4. Markierte Bakterien 3-mal mit 500 μl eiskaltem PBST waschen, um nicht umgesetztes Biotinylierungsreagenz zu entfernen.
   1. Suspension des Pellets in 1 mL PBST.

>2. Bindung des monomeren Avidin-Fusionsproteins an die biotinylierte BCG-Oberfläche

1. Mischen Sie 5 x 10⁸ biotinylierte BCG mit Avi-Protein (10 μg/mL endgültig in PBS-T) für 1 h bei Raumtemperatur auf der Shaker-Plattform.
2. Waschen Sie die Bakterien 3 Mal mit 500 μL eiskaltem PBST.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Endotoxinfrei RPMI 1640	StemCell-Technologien	Artikel-Nr.: 36750
Sulfo-NHS SS Biotin	Thermo Fischer	Artikel-Nr.: 21328
Middlebrook 7H9 Brühe	BD Diagnosesysteme	Artikel-Nr.: 271310
OADC	BD Diagnosesysteme	Nr. B11886
Tween 80	Sigma-Aldrich	Nr. P1379