Ein Assay zur Analyse von Test-β-Glucan als Immuntherapiestrategie gegen Hirntumorzellen

Zusammenfassung

Quelle: Folgado-Dorado, C. et al., Isolierung und Reinigung von Pilz-β-Glucan als Immuntherapiestrategie für Glioblastome. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay, bei dem β-Glucane verwendet werden, um Mikrogliazellen für die Produktion von Superoxidradikalen, einer reaktiven Sauerstoffspezies, zu aktivieren. In Hirntumorzellen unterdrücken die erzeugten reaktiven Oxidantien aktiv die Proliferation von Tumorzellen und induzieren den Zelltod.

Protokoll

In-vitro-Studie zur β-Glucan-induzierten Mikroglia-Stimulation

>1. Zellkultur von Glioblastom- und Mikrogliazellen der Maus in 8-Well-Kammer-Objektträgern

HINWEIS: Dieses Protokoll ist spezifisch für GL261 (Glioblastom) und BV2 (Mikroglia) Zelllinien. Mit leichten Modifikationen könnten diese Schritte jedoch möglicherweise zur Untersuchung anderer Krebs- und Immunzelllinien verwendet werden.

1. Bereiten Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco zu, das mit L-Glutamin, 4,5 g/l D-Glucose und ohne Pyruvat modifiziert ist. 10 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin zugeben. Das Material in einem Wasserbad bei 37 °C 15 min vorwärmen.
2. Tauen Sie die gefrorenen BV2- und GL261-Aliquots 2 Minuten lang in einem Wasserbad (37 °C) auf und geben Sie sie kurz vor dem vollständigen Auftauen in eine Laminar-Flow-Haube und geben Sie die Zellen in zwei verschiedene sterile T25-Kolben (einen für jede Zelllinie).
3. Die T25-Kolben werden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert, bis die Kultur konfluent ist.
   Anmerkung: Abhängig von den Gefrierbedingungen und der Zeit unter Kryokonservierung kann die Zeit bis zur Konfluenz variieren. Diese Zelllinien benötigen in der Regel zwischen 3 und 5 Tagen, um die Konfluenz in einem T75-Kolben zu erreichen.
4. Nachdem die BV2-Zellkultur konfluent geworden ist, überführen Sie sie in 8-Well-Kammer-Objektträger 0,6 x 10⁶ Zellen/Well. Bewahren Sie die 8-Well-Kammer-Objektträger 24 Stunden im Inkubator auf.
5. Sobald die Mikrogliazellen in die 8-Well-Kammer-Objektträger plattiert sind, wiederholen Sie das gleiche Protokoll mit den GL261-Zellen.

>2. Aktivierung von Mikroglia mit β-Glucanen

1. Beschichten Sie die BV2-Zellen 72 h lang mit vier verschiedenen β-Glucanen (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus) in einer Konzentration von 0,2 mg/ml. Eine Versuchsbedingung muss unbehandelt bleiben (normales Medium), die als Kontrollgruppe dient.
2. Den Überstand nach 72 h mit einer Pipette auffangen und das restliche Volumen durch einen 0,20 μm Spritzenvorsatzfilter leiten. Anschließend wird der Überstand bei -80 °C mindestens 24 h lang eingefroren.

>3. Behandlung von GL261 mit voraktiviertem Mikroglia-konditioniertem Medium

1. Sobald das GL261 zu 80 % in den 8-Well-Objektträgern konfluent ist, fügen Sie 72 h lang β-Glucan-behandeltes Mikrogliamedium mit einer endgültigen Volumenkonzentration von 25 % hinzu (Gesamtvolumen: 250 μl/Well).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
8-Well-Kammer-Objektträger	Thermo Fisher, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 171080
Dulbecco's modifizierte Eagle's Medium, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase)	Novozymes, Dänemark
Fötales Rinderserum	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	Nr. 1010-015
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis	Nr. P4458
Brutkasten	Eppedorf	Galaxie 170S