Ein Verfahren zur Behandlung dendritischer Zellen mit hohem Salzgehalt und deren adoptiver Transfer in Mäuse

Zusammenfassung

Quelle: Van Beusecum, J. P., et al. Isolierung und adoptiver Transfer von mit hohem Salzgehalt behandelten Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt ein Verfahren für den adoptiven Transfer von mit hohem Salzgehalt behandelten Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen (DCs) in Mäuse. Murine CD11c+ dendritische Zellen (DCs) werden einem Medium ausgesetzt, das hohe Mengen an Natrium enthält, und bilden in den Zellen Isolevuglandin (IsoLG)-Protein-Addukte. Diese Addukte dienen als Neoantigene und werden auf der Oberfläche von DCs präsentiert. Die mit hohem Salzgehalt behandelten Zellen werden durch adoptiven Zelltransfer in Mäuse injiziert.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Isolierung von Milz von Mäusen

1. Bereiten Sie 1640 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) vor: 10 % fötales Rinderserum (FBS), 0,10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES), 1 mM Natriumpyruvat, 50 μM β-Mercaptoethanol und 1 % Penicillin/Streptomycin.
2. Euthanasieren Sie 10–12 Wochen alte männliche C57bl/6-Mäuse durch CO₂ -Inhalation. Besprühen Sie die Brust und die Seiten der Maus mit 70% Ethanol. Öffnen Sie auf der linken Seite vorsichtig die Haut und die Bauchhöhle, um die Milz freizulegen.
3. Bewegen Sie den Darm und die Leber mit einer kleinen Pinzette vorsichtig auf die linke Seite der Maus und schneiden Sie mit einer feinen Schere vorsichtig die Milz heraus.
   Anmerkung: Dieser Schritt muss sehr vorsichtig durchgeführt werden, da eine Schädigung des Magen-Darm-Trakts zu einer Kontamination führen kann.
4. Legen Sie jede exzidierte Milz in ein beschriftetes konisches 15-ml-Röhrchen, das 3 ml RPMI 1640-Medium enthält.

>2. Erzeugung von einzelligen Suspensionen aus Milz

HINWEIS: Die Milz kann durch Kombination von mechanischer Dissoziation und enzymatischem Verdau in eine Einzelzellsuspension dissoziiert werden.

1. Bereiten Sie die Milzaufschlusslösung vor, indem Sie Kollagenase D (1 mg/ml; 0,29 U/mg lyophilisiert) und DNase I (0,1 mg/ml) zu vorbereitetem RPMI 1640-Medium hinzufügen (siehe Schritt 1.1)
2. Die Milz mit einer Pinzette in ein C-Rohr (Dissoziationsröhrchen) mit 3 ml Milzverdauungslösung überführen.
3. Führen Sie die mechanische Dissoziation mit einem halbautomatischen Homogenisator gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
   1. Setzen Sie das C-Rohr auf den halbautomatischen Homogenisator und stellen Sie sicher, dass das C-Rohr fest auf dem rotierenden Arm sitzt. Sobald die C-Röhre platziert ist, drücken Sie die Starttaste am halbautomatischen Homogenisator, um das Spleen 04.01-Protokoll für 60 s.
      auszuführen HINWEIS: Die mechanische Dissoziation kann auch durchgeführt werden, indem ein 40-μm-Filter auf ein konisches 50-ml-Röhrchen gelegt und die Milz vorsichtig durch den Filter geschliffen wird. Nach dem Schleifen der Milz den 40 μm Filter mit 10 mL RPMI-Medium durchspülen.
4. Nach der mechanischen Dissoziation das Röhrchen vom Homogenisator lösen und den enzymatischen Aufschluss durchführen. Die Proben werden 15 Minuten lang bei 37 °C unter kontinuierlicher Rotation (20 U/min) inkubiert.
5. Übertragen Sie die Lösung, indem Sie sie nach dem Filtrieren durch ein 40-μm-Sieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen pipettieren. Waschen Sie das 40 μm Sieb mit 10 mL Dulbecco's PBS (dPBS). Die Zellen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
6. Nach der Zentrifugation wird der Überstand vollständig abgesaugt und das Pellet gewaschen, indem es in 10 mL dPBS resuspendiert wird. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.

>3. Isolierung von CD11c⁺ DCs aus Milz-Einzelzellsuspension

1. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml dPBS und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und einem Trypanblau-Ausschluss.
2. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
3. Der Überstand wird vollständig aspiriert und das Pellet in 400 μl magnetisch aktiviertem Zellsortierpuffer (MACs) resuspendiert.
4. Fügen Sie 100 μl CD11c-Mikrokügelchen (siehe Materialtabelle) pro 1 x 10⁸ Zellen hinzu.
5. Die Zellsuspension vortexen und 10 min im Kühlschrank bei 4 °C inkubieren.
6. Geben Sie 10 ml MACs-Puffer in die Waschzellen. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
7. Der Überstand wird vollständig aspiriert und in 500 μl MACs-Puffer resuspendiert.

>4. Magnetische Trennung von CD11c⁺ DCs

HINWEIS: Die magnetische Trennung erfolgt manuell mit einem Magnetabscheider (siehe Materialtabelle), der mit LS-Säulen ausgestattet ist. Die magnetische Trennung kann auch automatisch mit einem automatisierten Magnetabscheider erfolgen. (siehe Materialtabelle).

1. Platzieren Sie die LS-Säule in das Magnetfeld des MAC-Separators und ein konisches 15-ml-Röhrchen unter jede Säule, um den Durchfluss aufzufangen.
2. Spülen Sie die LS-Säule mit 3 mL Puffer
.
3. Legen Sie die Zellsuspension auf jede LS-Säule und sammeln Sie den Durchfluss mit unmarkierten Zellen.
4. Waschen Sie die LS-Säule mit 3 mL MACs-Puffer und sammeln Sie die unmarkierten Zellen, die passieren. Waschen Sie die LS-Säule noch 2 Mal.
5. Entfernen Sie die LS-Säule aus dem Magnetabscheider. Geben Sie 5 mL MACs-Puffer in jede Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie die LS-Säule fest in ein sauberes konisches 15-ml-Röhrchen eintauchen.
   Anmerkung: Es ist wichtig, eine doppelte Isolierung von CD11c-Zellen durchzuführen, um eine hochreine Zellsuspension zu erhalten. Wiederholen Sie daher die Schritte 3.1 bis 4.5. und siehe Abbildung 4 für Reinheitsstandards. Dieser Schritt verbessert die Reinheit der CD11c⁺-Zellen auf 90–95 %.
6. Bestimmen Sie die ^CD11c+ DC-Zahl auf einem Hämozytometer mit Trypanblau-Ausschluss. Die Zellprobe wird im Verhältnis 1:1 in 0,4%iger Trypanblau-Lösung verdünnt.
   HINWEIS: Nicht lebensfähige Zellen werden blau gefärbt, während lebensfähige Zellen ungefärbt bleiben.
   1. Füllen Sie dazu vorsichtig ein Hämozytometer mit 10 μl der Zellprobenverdünnung und inkubieren Sie 1 Minute lang.
   2. Zählen Sie die Zellen in 4 Quadraten von 1 x 1 mm² in der geladenen Kammer, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu bestimmen.

>5. In-vitro-Behandlung von CD11c⁺ DCs mit hohem Salzgehalt

1. Bereiten Sie das DC-Kulturmedium vor, indem Sie 10 % FBS, 0,1 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 μM β-Mercaptoethanol und 1 % Penicillin/Streptomycin zu 500 mL 1640 RPMI hinzufügen.
2. Bereiten Sie 10x DC-Zellkulturmedien mit hohem Salzgehalt (400 mM) vor, indem Sie 1,17 g NaCl abwiegen und in ein steriles 50-ml-Falcon-Röhrchen geben. 50 ml steriles DC-Zellkulturmedium (hergestellt in Schritt 5.1) in das 50-ml-Falcon-Röhrchen geben und vortexen, bis das NaCl in Lösung ist.
3. Filtrieren Sie die DC-Kulturmedien mit hohem Salzgehalt sofort durch Vakuumfiltration durch einen 0,2-μm-Filter in einer Zellkulturhaube.
4. Zentrifugieren Sie jede Zellsuspension aus der Milz bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in DC-Kulturmedien in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml.
5. Pipettieren Sie 900 μl (ca. 1 x 10⁶ Zellen) der DC-Suspension in einer 24-Well-Falcon-Platte mit flachem Boden. Geben Sie 100 μl DC-Nährmedien mit hohem Salzgehalt in jede Vertiefung, um eine endgültige Natriumkonzentration von 190 mM zu erreichen. Beschriften Sie die Platte und stellen Sie sie für 48 h in einen 37 °C humifizierten CO₂ -Inkubator.

>6. Adoptiver Transfer von hochsalzbehandelten CD11c⁺ DCs

1. Nach 48 h In-vitro-Stimulation nehmen Sie die Platte aus dem 37 °C humifizierten CO₂ -Inkubator.
2. Pipettieren Sie das Zellkulturmedium auf und ab, um die CD11c⁺ DCs zu resuspendieren. Pipettieren Sie die gesamte CD11c⁺ DC-Suspension in ein entsprechend markiertes 1,6-ml-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jede einzelne gut plattierte Person.
3. Jede CD11c⁺ DC-Suspension wird 10 min lang bei 4 ΰC bei 300 x g zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt. Resuspendieren Sie das DC-Pellet mit 100 μl sterilem dPBS.
4. Ziehen Sie die DC-Suspension in eine 1-ml-Spritze, die mit einer 27 G 1/2-Zoll-Nadel ausgestattet ist.
5. Platzieren Sie die naiven männlichen 10 Wochen alten C57bl/6-Mäuse unter 2 % Isofluran, um eine stabile chirurgische Ebene zu erreichen. Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie mit dem Fehlen eines Pedalreflexes. Sobald eine stabile chirurgische Ebene erreicht ist, führen Sie die Nadel langsam und vorsichtig in einem Winkel von ca. 30° in den retroorbitalen Raum ein.
   Anmerkung: Die Fase der 27-G-Nadel sollte nach unten zeigen, weg vom Auge, um Augenschäden zu vermeiden.
6. Injizieren Sie langsam und sanft die CD11c⁺ DC-Suspension (ca. 1 x 10⁶ Zellen). Sobald die Injektion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Nadel vorsichtig aus dem retroorbitalen Raum und achten Sie darauf, das Auge nicht zu beschädigen.
   Anmerkung: Nach der Injektion sollte es zu geringen oder keinen Blutungen kommen. Der adoptive Transfer von CD11c⁺ DCs kann auch mit einer intravenösen Injektionsmethode (z. B. Schwanzvene) durchgeführt werden. Die Kontrollmäuse erhielten CD11c⁺ DCs, die in normalen Salzmedien kultiviert wurden.
7. Nehmen Sie die Mäuse aus dem Nasenkonus und überwachen Sie sie ca. 30 Minuten lang, während sie sich von der Narkose erholen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
APC/Cy7 Anti-Maus CD11c	Biolegende	117324
autoMACS Laufender Puffer	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-091-221
CD11c Mikroperlen ultrarein	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-108-338
Kollagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
dPBS ohne Calcium und Magnesium	Corning	21-031-CV
FcR-Blockierungsreagenz	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-092-575
FITC Anti-Maus CD45	Biolegende	103108
GentleMACS C Röhre	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-096-334
GentleMACS Dissoziator-Gerät	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-093-235	Anwendungsprotokoll: Milz 04.01
LIVE/DEAD reparierbares violettes Fleckenset für tote Zellen	Invitrogen	Nr. L34964
LS-Säulen	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-042-401
QuadroMACs Trenner	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-090-976
RPMI 1640 mittel	Gibco	Tel.: 11835-030