Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Entwicklung und Wartung von NIT-1-Zelllinien
- Pflegen Sie NIT-1-Zelllinien, die einen genetischen Hintergrund mit nicht-adipösen diabetischen (NOD) Mäusen teilen, und 293FT-Zellen in Gewebekulturen behandelten Schalen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glukose, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin, in einem 37 °C Inkubator mit 5 % CO2.
- Züchten Sie die 293FT-Zellen für die Transfektion auf 70%-80% Konfluenz.
- Kombiniert man pro 10-cm-Schale mit 293FT-Zellen 10 μg pLenti-Luciferase-blast (siehe Ergänzende Datei 1), die das Glühwürmchen-Luciferase-Transgen (luc2) exprimiert, unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven EF1α-Promotors, je 2 μg der Verpackungsplasmide pMD2.G, pMDLg/pRRE und pRSV-Rev, 4 μg des Hüllproteinplasmids pCMV-VSV-G, und 60 μg lineares Polyethylenimin (PEI) in 1 ml serumfreiem DMEM. Passen Sie die Mengen basierend auf der Anzahl der zu transfizierenden Zellen an.
- Lassen Sie DNA, PEI und DMEM 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) und fügen Sie sie dann den 293-Fuß-Zellen hinzu.
- Entnehmen Sie das Medium mit den lentiviralen Partikeln 48 h nach der Transfektion.
- Transduzieren Sie die NIT-1-Zellen bei ~80% Konfluenz mit 1 ml Medium, das lentivirale Partikel pro 106 Zellen für 48-72 Stunden enthält.
- Wählen Sie die Luciferase-exprimierenden Zellen mit 5 μg/mL Blasticidin für 48 h aus.
- Des Weiteren werden die Luciferase-exprimierenden Zellen genetisch modifiziert, um sie an die experimentelle Fragestellung anzupassen. Fügen Sie zum Vergleich eine Luciferase-exprimierende Wildtyp- oder Nicht-Targeting-Kontrollzelllinie hinzu.
Anmerkung: Beispiele für Modifikationen von Zielgenen sind CRISPR-Knockout (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), CRISPRa/i, shRNA-Knockdown und Überexpression.
>2. Vorbereitung von NIT-1-Zellen für die Transplantation
- Züchten Sie die Luciferase-exprimierenden Zellen, bis sie zu 80 % bis 90 % konfluent sind.
- Entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 5 mL für eine 10-cm-Schale).
- 1 ml 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (Trypsin-EDTA) für 2 Minuten in jede Schale geben.
- Neutralisieren Sie das Trypsin mit 5 ml Wachstumsmedium.
- Waschen Sie die Zellen mit einer Pipette von der Schale ab und geben Sie sie in ein konisches Röhrchen.
Anmerkung: Zellen aus mehreren Schalen derselben Zelllinie können kombiniert werden.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Färbemittel wie Trypanblau manuell mit einem Hämozytometer oder automatisch mit einem automatischen Zellzähler.
- Bei 250 × g 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand mit einer Ansaugpipette entfernen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS in einer Konzentration von 5 × 107 Zellen/ml (107 Zellen pro Zelllinie und Maus werden in einem Volumen von 200 μl transplantiert).
- Bewahren Sie die Zellen bis zur Transplantation auf Eis auf (bis zu 3 Stunden).
>3. Transplantation von NIT-1-Zellen in nicht-adipöse Mäuse mit diabetischer schwerer kombinierter Immundefizienz (NOD-scid)
- Betäuben Sie die Empfängermäuse (8-10 Wochen alte NOD-scid-Mäuse des gleichen Geschlechts wie die Mäuse, die zur Isolierung der Splenozyten verwendet wurden) durch Isofluran-Inhalation in einer Knockdown-Kammer. Geben Sie 2,5 % Isofluran mit einer Durchflussrate von 1,5 l/min und einer Evakuierungsrate von 9 l/min in die Kammer.
- Schmieren Sie die Augen des Tieres mit Augensalbe ein, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Entfernen Sie mit einem Elektrorasierer mit Schutz die Haare vom Rücken (Rückenseite) der Mäuse, um die Haut freizulegen. Der rasierte Transplantationsbereich beträgt etwa 1 Zoll x 2 Zoll. Bringen Sie die rasierten Mäuse bis zur Transplantation in die Knockdown-Kammer zurück.
- Übertragen Sie die Mäuse nacheinander auf eine saubere Oberfläche mit einem Isofluran-Nasenkegel. Führen Sie den Kopf der Maus vorsichtig in den Nasenkegel. Verwenden Sie eine Isofluran-Flussrate von 0,25 l/min, um die Anästhesie während der Transplantation aufrechtzuerhalten.
- Wischen Sie den Transplantationsbereich mit einem Isopropylalkohol-Vorbereitungspad ab, um lose Haare zu entfernen und die Haut zu desinfizieren.
- Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig resuspendiert sind, bevor Sie die Spritze laden. Ziehen Sie ein überschüssiges Volumen (>300 μl) Zellen mit einer 26-g-Nadel in eine sterile 1-ml-Spritze. Entfernen Sie alle Blasen; dann überschüssige Zellen wieder in das Röhrchen geben, so dass 300 μl Zellsuspension in der Spritze verbleiben.
- Heben Sie mit einer gebogenen Pinzette, die Sie in der nicht dominanten Hand halten, die Haut auf einer Seite (links oder rechts) des Rückens der Maus vorsichtig an, um einen leichteren Zugang zum Unterhautraum zu ermöglichen.
- Positionieren Sie die Spritze mit der dominanten Hand parallel zur koronalen und sagittalen Ebene des Mauskörpers. Führen Sie die Nadel mit der Nadel in Richtung des Mauskopfes in die Haut in der Nähe der Hinterhand ein und führen Sie sie vorsichtig in den Unterhautraum. Achten Sie darauf, dass die gesamte Nadel unter der Haut bleibt und nicht durchsticht.
- Stellen Sie die Pinzette so ein, dass sie die Haut sanft um die Basis der Nadel hält. Geben Sie langsam eine kleine Menge Zellsuspension (<50 μl) ab und bestätigen Sie, dass sich an der Injektionsstelle eine kleine Ausbuchtung unter der Haut bildet. Setzen Sie die Injektion der Zellsuspension fort, bis 200 μl in den subkutanen Raum abgegeben wurden.
- Halten Sie die Pinzette an Ort und Stelle, halten Sie die Nadel parallel zum Körper der Maus und ziehen Sie die Nadel langsam zurück. Nachdem die Nadel entfernt wurde, halten Sie die Haut einige Sekunden lang mit einer Pinzette geschlossen, um zu verhindern, dass die Zellen aus der Stichwunde austreten.
- Wenn eine genetische Veränderung evaluiert wird, wiederholen Sie die Transplantation auf der gegenüberliegenden Seite der Maus mit einer anderen Spritze, so dass sowohl mutierte als auch Kontrollzellen in jede Maus injiziert werden, wobei sich eine Zelllinie links und die andere rechts befindet. Wenn nur eine Zelllinie transplantiert wird, injizieren Sie die Zellen nur auf einer Seite.
- Setzen Sie jede Maus nach der Transplantation in einen frischen Käfig um. Lassen Sie jede Maus sich vollständig von der Narkose erholen, bevor Sie weitere Mäuse in den Käfig legen.
Anmerkung: Mäuse erholen sich, wenn sie ihre normalen Aktivitäten wieder aufnehmen und keine Anzeichen von Lethargie oder Bewegungseinschränkungen zeigen.
- Bewerten Sie den Gesundheitszustand der Mäuse täglich für die Dauer des Experiments nach der Transplantation. Wenn die Transplantate eine große Wölbung bilden oder die Mäuse schwach und lethargisch werden, messen Sie ihren Blutzucker und geben Sie allen hypoglykämischen Mäusen 10 % (w/w) Saccharosewasser ad libitum. Befolgen Sie alle tierärztlichen Empfehlungen und euthanasieren Sie alle Mäuse mit anhaltend schlechtem Körperzustand gemäß den institutionellen Richtlinien. In dieser Studie wurden Mäuse durch CO2 -Inhalation mit anschließender Zervixluxation euthanasiert.
>4. Isolierung und Reinigung autoreaktiver Splenozyten
- Identifizieren Sie 10-16 Wochen alte männliche oder weibliche NOD-Mäuse mit kürzlich aufgetretenem Diabetes (weniger als 10 Tage) mit Hilfe von Urin- (oder Blut-) Glukoseteststreifen. NOD-Mäuse gelten als Diabetiker, wenn sie an mindestens 2 aufeinanderfolgenden Tagen einen Urin-/Blutzuckerspiegel von ≥250 mg/dl aufweisen.
Anmerkung: Für jede NOD-scid-Maus werden 10 Millionen Milnozyten benötigt; Eine Milz liefert in der Regel 50 bis 150 Millionen Splenozyten. Die Splenozyten wurden von erregerfreien Mäusen isoliert, die in einer von Sentinal überwachten Einrichtung untergebracht waren.
- Euthanasieren Sie die entsprechende Anzahl von diabetischen NOD-Mäusen.
Anmerkung: In dieser Studie wurden die Mäuse durch CO2 -Inhalation eingeschläfert, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation, um den Tod sicherzustellen.
- Machen Sie mit der Maus auf dem Rücken mit einer chirurgischen Schere einen etwa 2 Zoll langen vertikalen Schnitt in die Haut. Öffnen Sie die rechte Seite der Maus aus der Sicht des Forschers und lokalisieren Sie die leuchtend rote Milz. Schneiden Sie die Milz vorsichtig von der rosa Bauchspeicheldrüse ab und geben Sie sie in eine sterile 10 cm Petrischale, die 5 ml steriles PBS enthält. Wiederholen Sie die Dissektion mit so vielen Mäusen wie nötig.
Anmerkung: Milz von mehreren Mäusen kann in einer Schale kombiniert werden. Führen Sie die folgenden Schritte mit sterilen Reagenzien und Geräten in einer sterilen Haube durch.
- Zerdrücken Sie die Milz(en) mit der flachen Oberseite eines sterilen Spritzenkolbens.
- Legen Sie ein 40 μm oder 70 μm Sieb in ein konisches 50 mL Röhrchen und waschen Sie das Sieb mit 5 mL PBS, um es zu grundieren. Übertragen Sie die Milzsuspension(en) in das Sieb und pürieren Sie weiter sanft durch das Sieb. Spülen Sie das Geschirr mit 10 mL PBS ab und geben Sie die Wäsche auf das Sieb. Fahre mit dem Pürieren fort, bis die rote Farbe vom Sieb verschwunden ist.
- Entsorgen Sie das Sieb und drehen Sie das Röhrchen bei 500 × g für 5 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand mit einer Ansaugpipette.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml (für bis zu drei Milzen) ACK-Lysepuffer, der auf RT vorgewärmt ist, und lysieren Sie die roten Blutkörperchen 4 Minuten lang. Erhöhen Sie das Volumen um 1-2 ml pro Milz, wenn zusätzliche Milz benötigt wird.
- Stoppen Sie die Reaktion mit 5 mL NIT-1-Zellmedium (oben beschrieben) pro 5 mL Lysepuffer. Geben Sie die Zellsuspension durch ein frisches Sieb, um Klumpen zu entfernen. Das Sieb wegwerfen und bei 500 × g 5 min bei RT schleudern.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 ml PBS und zählen Sie die Zellen. Bei 500 × g für 5 min bei RT schleudern. Die Zellen in sterilem PBS in einer Konzentration von 1 × 108 Zellen/ml (das Injektionsvolumen beträgt 0,1 ml/Maus) in einem 1,5 ml-Reaktionsröhrchen mit sicherem Verschluss resuspendieren.
- Lagern Sie die Zellen auf Eis (nicht länger als 1 Stunde) oder halten Sie die Zellen auf RT und fahren Sie sofort mit der Schwanzveneninjektion fort.
>5. Intravenöse Injektion von diabetischen Splenozyten über die Vena tail lateralis
- Erwärmen Sie den Körper der erwachsenen NOD-SCID-Empfängermäuse (z.B. mit einer Wärmelampe für ~5-10 min), um die Venen zu vasodilatieren (dies hilft bei der Visualisierung und Injektion in die Vene).
Anmerkung: Um eine Überhitzung der Mäuse zu vermeiden, sollten Sie diese Zeit nicht überschreiten. Überwachen Sie immer den Gesundheitszustand. Wenn die Mäuse erschöpft oder unbeweglich erscheinen, schalten Sie die Wärmelampe sofort aus.
- Erwärmen Sie die Zellsuspension. Bereiten Sie eine sterile Spritze (0,3-1,0 ml) mit einer sterilen Nadel (27-30 g, 0,3 mm/0,5 Zoll oder kleiner) vor oder verwenden Sie eine sterile 0,5-ml-Insulinspritze mit einer 0,3-mm-Nadel (0,5 Zoll). Halten Sie die Nadel immer steril und verwenden Sie ein steriles Tablett, wenn die Spritze zwischen den Injektionen abgelegt werden muss.
- Resuspendieren Sie die Splenozytenlösung vor jeder Injektion. Für jede Maus werden 100 μl der vorgewärmten und gemischten Splenozytensuspension in die Spritze aufgezogen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze oder in der Suspension befinden.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass Sie alle Geräte und Verbrauchsmaterialien vorbereitet haben (Alkoholtupfer zur Desinfektion, eine Spritze mit den zu injizierenden Splenozyten und einen frischen Käfig zur Trennung der injizierten Mäuse), bevor Sie die Maus in die Rückhaltevorrichtung einsetzen.
- Setzen Sie die Maus in die Rückhaltevorrichtung ein. Fassen Sie den Schwanz mit der nicht-dominanten Hand und lokalisieren Sie eine der beiden seitlichen Schwanzvenen. Drehen Sie den Schwanz bei Bedarf vorsichtig. Wischen Sie den Schwanz mit einem Desinfektionstuch (70% Isopropylalkohol) ab, um die Haut zu reinigen und die Sichtbarkeit der Vene zu erhöhen.
- Führen Sie die Nadel mit der dominanten Hand in einem spitzen Winkel in den mittleren Bereich des Schwanzes ein. Schieben Sie die Nadel mit der Fase nach oben einige Millimeter durch die Haut.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Nadel parallel zur Vene verläuft und nur leicht unter der Haut platziert wird. Seien Sie auf plötzliche Bewegungen der Maus/des Schwanzes direkt nach dem Eindringen in die Haut-/Gefäßwand vorbereitet. Ein erfolgreiches Einstechen der Nadel sollte sich wie ein "sanftes Gleiten" in die Vene anfühlen. Wenn ein weiterer Versuch erforderlich ist, bewege dich weiter den Schwanz hinauf in Richtung Körper.
- Üben Sie leichten Druck auf die Spritze aus, um die Splenozytensuspension zu injizieren. Lassen Sie die Nadel beim Injizieren nicht weiter hinein- oder herausbewegen. Erfolgreiche Injektionen verlaufen reibungslos, ohne dass während der Injektion ein Gegendruck zu spüren ist, und werden durch einen transparenten/weißen Blutfluss unmittelbar nach der Injektion angezeigt.
- Lösen Sie die Nadel vorsichtig aus der Vene und üben Sie mit einem Desinfektionstuch leichten Druck auf den Schwanz aus, bis die Blutung aufhört. Lösen Sie die Maus aus der Rückhaltevorrichtung und setzen Sie sie vorsichtig in einen frisch vorbereiteten Käfig.
Anmerkung: Injizieren Sie zwei bis drei Kontrollmäuse, die keine NIT-1-Zelltransplantation erhalten, Splenozyten, um das Potenzial der autoreaktiven Splenozyten zur Induktion von Diabetes zu bestätigen, was etwa 2-4 Wochen nach der Injektion dauert.
>6. In vivo biolumineszierende Bildgebung von NIT-1-Transplantaten
HINWEIS: Bilden Sie die Transplantate ein- bis zweimal pro Woche ab. Warten Sie am Tag der Transplantation mindestens 2 Stunden nach der Transplantation, damit sich die Transplantate absetzen und eine stabile Luciferase-Expression gewährleistet ist. Wenn die Zeit ein limitierender Faktor ist, kann die erste Messung stattdessen am Tag 1 durchgeführt werden. Ein empfohlener Zeitplan für die erste Bildgebung ist Tag 0 oder Tag 1 nach der Injektion, Tag 5, Tag 10, Tag 14, Tag 18 und Tag 25. Passen Sie den Zeitplan jedoch basierend auf dem Fortschritt der Autoimmunität an, der anhand des Verlusts des Biolumineszenzsignals beurteilt wird.
- Bereiten Sie eine 15 mg/ml D-Luciferin-Lösung in Dulbecco's PBS vor. Rühren Sie bei RT auf, um sich aufzulösen, und steriler Filter (0,22 μm). 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern und bei Bedarf auftauen.
Anmerkung: Die Aliquots können wieder eingefroren werden.
- Mindestens 5 Minuten vor der Bildgebung injizieren Sie die Mäuse intraperitoneal mit einer 1-ml-Spritze und einer 26-g-Nadel mit D-Luciferin-Lösung in einer Dosis von 150 mg/kg.
Anmerkung: Verwenden Sie für jede Maus eine frische Spritze und eine Nadel.
- Betäubung der Mäuse durch Isofluran-Inhalation nach institutionellen Richtlinien. Die empfohlenen Bedingungen sind 2,5 % Isofluran mit einer Flussrate von 1,5 l/min in die Knockdown-Kammer und einer Evakuierungsrate von 9 l/min.
- Schmieren Sie die Augen des Tieres mit Augensalbe ein, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Öffnen Sie die Software, die mit dem bildgebenden Instrument verknüpft ist. Erstellen Sie einen neuen Benutzer und/oder Login. Wählen Sie in der Systemsteuerung unten rechts die Option Initialisieren aus (Abbildung 1A). Um die Bilddaten automatisch zu speichern, erstellen Sie die entsprechenden Ordner auf dem Computer, und wählen Sie dann Erfassung | Automatisch speichern unter... (Abbildung 1A). Sobald das Gerät mit der Initialisierung fertig ist, stellen Sie die Belichtungszeit auf 1 min ein.
Anmerkung: Die vollständigen Bildgebungsparameter sind in Abbildung 1B dargestellt.
- Übertragen Sie die Mäuse nacheinander aus der Knockdown-Kammer auf das Bildgebungsinstrument. Lege die Maus mit gespreizten Gliedmaßen auf den Bauch und führe ihren Kopf vorsichtig in den Nasenkegel. Eine Isofluran-Flussrate von 0,25 l/min, die über einen Nasenkonus verabreicht wird, ist angemessen, um die Anästhesie während der Bildgebung aufrechtzuerhalten. Glätten Sie die Maus vorsichtig, indem Sie mit beiden Händen auf die Mitte des Rückens drücken und dann die Hände nach außen und auseinander spreizen.
- Wählen Sie Acquire (Erfassen) (Abbildung 1B). Notieren Sie alle relevanten Details des Experiments im Popup-Fenster (Abbildung 1C).
Anmerkung: In Abbildung 2A finden Sie repräsentative Bilder von drei 8 Wochen alten weiblichen NOD-scid-Mäusen, die zu verschiedenen Zeitpunkten mit zwei Transplantaten transplantiert wurden.
