Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Materialien und Reagenzien
- Verwenden Sie weibliche Anopheles stephensi-Mücken (Stamm Sda500), die sich 3-5 Tage nach dem Schlüpfen von infizierten Mäusen ernähren und sich wie zuvor beschrieben aufziehen.
- Verwenden Sie den Parasiten Plasmodium berghei ANKA-Klon, der das Gen für das Green Fluorescent Protein (GFP) exprimiert, unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors Heat Shock Protein 70 (HSP70). Dies führt zu einer hellen Fluoreszenz während des gesamten Lebenszyklus des Parasiten.
- Verwenden Sie weibliche C57BL/6JRj-Mäuse (7 Wochen alt).
Anmerkung: Alle Reagenzien, die in dem beschriebenen Protokoll verwendet werden, sind in der Tabelleder Materialien/Geräte aufgeführt.
>2. Strahlungsgedämpfte Sporozoitenisolierung aus Speicheldrüsen der Mücke
- Zwischen 18 und 25 Tagen nach der infektiösen Blutmahlzeit sammeln und kältebetäuben Sie die Mücken in einem 15-ml-Röhrchen auf Eis, wie zuvor beschrieben. Übertragen Sie sie vorsichtig in eine Petrischale, indem Sie das Röhrchen umdrehen. Halten Sie die Insekten auf Eis und setzen Sie die Mücken einer Dosis von 12 Krad γ- oder Röntgenbestrahlung aus.
- Isolieren Sie abgeschwächte Sporozoiten aus bestrahlten Speicheldrüsen der Mücke, wie zuvor beschrieben. Infizierte Speicheldrüsen in einem kleinen Volumen (ca. 15 μl) von 1x Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) auf Eis sammeln und vorsichtig zerkleinern, um Sporozoiten freizusetzen.
Anmerkung: Da die Injektion einer hochkonzentrierten Parasitensuspension in einem kleinen Volumen kritisch ist, ist es unerlässlich, eine ausreichende Anzahl von Speicheldrüsen von einer großen Anzahl vorausgewählter, gut infizierter Mücken zu gewinnen, was durch ihre robuste Expression von grüner Fluoreszenz belegt wird.
- Filtrieren Sie die Sporozoit-Suspension durch eine 35-μm-Zellsiebkappe, die an ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adhäsion angepasst ist, um Klumpen und Mückenrückstände zu entfernen.
- Zählen Sie die Gesamtzahl der isolierten Sporozoiten wie zuvor beschrieben und passen Sie die Konzentration der Parasitensuspension mit kaltem 1x DPBS an, um 83.000 Sporozoiten/μl zu erhalten. Lagern Sie die Parasiten auf Eis, während Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.
- Es wird die entsprechende Anzahl von Speicheldrüsen von nicht infizierten Mücken entnommen, die als Negativkontrolle verwendet werden, und die Probe wie in den Schritten 2.2 und 2.3 beschrieben verarbeitet. Die Probe wird wie oben angegeben verdünnt, um eine ähnliche Konzentration von Speicheldrüsenextrakten in der Suspension zu erhalten.
Anmerkung: Sporozoiten können maximal 2 Stunden auf Eis gelagert werden. Im Idealfall werden sie jedoch innerhalb einer Stunde nach dem Zerkleinern der Speicheldrüsen injiziert.
>3. Injektion von Sporozoiten in die Hautschicht des Ohres
- Betäubung der Tiere durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg). Warten Sie 5-8 Minuten, bis sich die Maus in einem Zustand der Bewusstlosigkeit befindet, und tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie an beiden hinteren Füßen eine sanfte Zehenkneifung durchführen.
Anmerkung: Die Dosis der Anästhesie dauert weniger als 20 Minuten, so dass die nächsten Schritte schnell durchgeführt werden müssen.
- Stabilisieren Sie die Ohrmuschel der Maus, indem Sie die Bauchseite mit einem durchsichtigen Klebeband fixieren, das zuvor unter einem Stereomikroskop platziert wurde (Abbildung 1A). Drücken Sie sanft auf das Ohr, um eine Beschädigung des Gefäßsystems zu vermeiden.
- Laden Sie eine 10-μl-Spritze/eine abgeschrägte 35-Gauge-Nadel mit 0,6 μl resuspendierten Parasiten.
- Verabreichen Sie die Sporozoit-Suspension in 4 Injektionsstellen (0,15 μl pro Injektionsstelle), indem Sie die Nadel vorsichtig auf der dorsalen Seite des Ohrs (Abbildung 1A) unterhalb der Epidermis mit der Abschrägung nach oben einführen und darauf achten, dass keine Blutgefäße vorhanden sind. Lassen Sie die Nadel einige Sekunden in der Dermis verbleiben, um einen Rückfluss des Injektors zu verhindern, bevor Sie es entfernen. Am Ende des Eingriffs ist an jeder Injektionsstelle eine charakteristische Papel zu beobachten (Abbildung 1B und 1C).
- Entfernen Sie nach der Injektion vorsichtig das Ohr vom Klebeband.
- Injizieren Sie das kontralaterale Ohr mit der gleichen Dosis an Parasiten, indem Sie die Schritte 3.2-3.4 befolgen.
- Injizieren Sie 2 weitere Mäuse entweder 0,6 μl 1x DPBS oder 0,6 μl 1x DPBS + Speicheldrüsenextrakt von nicht infizierten Mücken, um die Entzündungsreaktion zu bewerten, die allein durch die Injektion und die Ablagerung von Mückenmaterial in der Dermis ausgelöst wird.
- Überwachen Sie die Genesung der Maus nach der Narkose, bevor Sie sie wieder in den Käfig setzen.
Anmerkung: Die korrekte Ablagerung von Sporozoiten in der Haut kann durch Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 2A und 2B) überwacht werden, wobei die Maus wie zuvor beschrieben präpariert wird.
