>1. Kultivierung humaner iPSCs (hiPSCs) auf embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF)
HINWEIS: Alternative Methoden zur Kultivierung von hiPSCs können ebenfalls verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Aussaat auf eine 6-Well-Platte, die mit Gelatine, einer gallertartigen Proteinmischung, rekombinantem Laminin 511 oder einer anderen extrazellulären Matrix, die bei der hiPS-Expansion verwendet wird, vorbeschichtet ist und unter Verwendung definierter Medien kultiviert wird, die speziell für die humane pluripotente Stammzellkultur formuliert sind.
- MEF kultivieren
- Eine 10 cm große Zellkultur-Petrischale mit 4 ml 0,1 % Gelatine beschichten und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
- Tauen Sie ein Fläschchen mit 4 x 106 bestrahltem MEF schnell in 10 ml MEF-Medium mit 37 °C auf (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] + 10% fötales Rinderserum (FBS) + 1x Penicillin-Streptomycin + 1x L-Glutamin-Supplement). Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 9 mL MEF-Medien.
- Nehmen Sie die mit Gelatine überzogene Schale aus dem Inkubator. Aspirieren Sie Gelatine und fügen Sie 7 ml MEF-Medium hinzu. 3 ml MEF-Suspension (aus Schritt 1.1.2) auf die mit Gelatine überzogene Schale geben. Wiegen Sie die Schüssel von Seite zu Seite und von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung von MEF auf der Schüssel zu gewährleisten. Bei 37 °C 8-36 h inkubieren.
- Passieren von hiPSC auf MEF
HINWEIS: Die Daten wurden unter Verwendung eines Melanom-Antigens generiert, das von T-Zellen 1 (MART-1) iPSC erkannt wird, das aus langfristig kultivierten Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) stammt, die spezifisch das MART-1-Peptid im Zusammenhang mit dem humanen Leukozytenantigen (HLA)-A*02:01 erkennen.
- Passage von hiPSCs bei Kolonien mit einem Durchmesser zwischen 0,8 und 1,2 mm. Überprüfen Sie vor der Passage die hiPSC-Kolonien in einem Stereomikroskop und entfernen Sie alle Differenzierungsbereiche aus der Kultur mit dem Kunststoffrand einer 200-μl-Spitze.
- Aspirieren Sie verbrauchte Medien und fügen Sie 10 ml hiPSC-Medien hinzu (Kulturmedien für humane embryonale Stammzellen [ES] [Table of Materials] + 10 ng/ml humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor [hbFGF]), ergänzt mit 10 μM Rho-assoziierter Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor.
- Halten Sie die Zellkulturschale in einer Hand und rollen Sie ein Einweg-Zellpassierwerkzeug in eine Richtung über die gesamte Schale. Üben Sie genügend Druck aus, so dass die gesamte Klinge die Kulturschale berührt und während des Walzens einen gleichmäßigen Druck aufrechterhält.
- Drehen Sie die Kulturschale um 90° und wiederholen Sie Schritt 1.2.3. Betrachten Sie die Platte im Mikroskop, um den korrekten Schnitt der Kolonien visuell zu bestätigen, die kariert erscheinen sollten. Lösen Sie geschnittene Kolonien durch sanftes mechanisches Spülen mit einer 200 μl Pipette.
Anmerkung: Das Ablösen der geschnittenen Kolonien durch mechanisches Spülen muss unmittelbar nach dem Schneiden der Kolonien mit der Walze erfolgen, da sich die geschnittenen Kolonien nach 3 Minuten wieder an der Schale festsetzen und es schwierig wird, Kolonien homogener Größe durch Spülen zu lösen.
- Übertragen Sie 350 - 600 Klumpen geschnittener Kolonien auf eine neue 10-cm-Schale mit MEF (plattiert 8 - 36 h vor der hiPSC-Passage) mit 10 mL frischem hiPSC-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor. Inkubieren bei 37 °C.
HINWEIS: 600 Klumpen entsprechen etwa 1,0 x 106 MART-1 iPSC und ergeben an Tag 35 0,5-1,0 x 106 DP-Zellen. Die erwarteten Zahlen variieren jedoch je nach Potenz der Ausgangszelllinie und den Kulturbedingungen.
- Am nächsten Tag aspirieren Sie verbrauchte Medien und fügen Sie 10 ml frisches hiPSC-Medium hinzu. Wechseln Sie das hiPSC-Medium alle 1-2 Tage, abhängig von der hiPSC-Wachstumsrate.
2. Vorbereitung von OP9/DLL1-Zellen für die Co-Kultur mit hiPSCs
- Kultivieren Sie OP9/DLL1-Zellen in OP9-Medien [α-Minimum essentielles Medium (α-MEM) + 20 % fötales Rinderserum (FBS) + 1x Penicillin-Streptomycin] bei 37 °C. Wenn OP9/DLL1-Zellen die Konfluenz erreichen, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie es einmal mit 5 ml 1x Magnesium-, Calcium- und Phenolrot-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 2 ml 0,05 % Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzu. 5 min bei 37 °C inkubieren. Fügen Sie dann 4 ml OP9-Medium hinzu und dissoziieren Sie die Zellschicht mechanisch durch Pipettieren, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 50-ml-Röhrchen durch ein 100-μm-Zellsieb, um Zellklumpen zu vermeiden. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird aspiriert und in 12 ml OP9-Medium resuspendiert.
- Geben Sie 8 ml OP9-Medien in sechs neue 10-cm-Zellkultur-Petrischale. 2 ml OP9/DLL1-Zellsuspension aus Schritt 2.3 auf jede neue 10-cm-Schale auffüllen. Schütteln Sie die Schale von Seite zu Seite und dann von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung von OP9/DLL1 auf der Schale zu gewährleisten.
- Inkubieren bei 37 °C. Wiederholen Sie die Passage alle 2 - 3 Tage, wenn die Zellen die Konfluenz erreicht haben.
Anmerkung: Es ist wichtig, genügend gefrorene Brühe von OP9/DLL1-Zellen herzustellen und alle 4-6 Wochen eine neue Brühe aufzutauen.
>3. In vitro Differenzierung von hiPSCs in CD8αβ+ Single positive (SP) T-Zellen
- Bereiten Sie gelatinierte OP9/DLL1-Gerichte eine Woche vor der Co-Kultur mit hiPSCs zu. Um eine 0,1%ige Gelatinelösung herzustellen, fügen Sie 5 ml Laborgelatinelösung (RT) bei Raumtemperatur (RT) zu 500 ml PBS hinzu.
- Beschichten Sie 3 neue 10-cm-Zellkultur-Petrischalen mit 4 ml 0,1 % Gelatine pro Schale. 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Aspirieren Sie Gelatine und geben Sie 8 ml OP9-Medium in jede Schale. Eine konfluente Schale von OP9/DLL1 (wie in Abschnitt 2 oben gemacht) wird in drei mit Gelatine vorbeschichtete Schalen geleitet.
- Geben Sie nach 4 Tagen 10 ml OP9-Medium in jede 10-cm-Schale OP9/DLL1 auf Gelatine, um 20 mL Medium pro Schale zu erhalten.
- Nach 7 - 8 Tagen beginnen Sie mit der hiPSC-Co-Kultur auf OP9/DLL1-konfluenten Gerichten (Differenzierungstag 0).
- Aspirieren Sie verbrauchte Medien aus einer konfluenten 10-cm-Schale von hiPS-Zellen auf MEF. Fügen Sie 10 ml OP9-Medium hinzu. Schneiden und trennen Sie hiPS-Kolonien mit einem Einweg-Zellpassage-Werkzeug, wie in den Schritten 1.2.3 und 1.2.4 beschrieben.
- 350 - 600 Klumpen geschnittener Kolonien werden mit einer 200-μl-Pipette auf eine 10 cm große, vorgelatinierte OP9/DLL1-Schale (Schritt 3.1) mit 10 mL frischem OP9-Medium übertragen. Schütteln Sie die Kulturschale von Seite zu Seite und dann von vorne nach hinten, um eine gleichmäßige Verteilung der Bienenvölker zu gewährleisten.
Anmerkung: Alternativ können vorgeformte hiPSC-Embryoidkörper (EBs) oder kleine Klumpensuspensionen verwendet werden. Die Verwendung eines Einweg-Zellpassage-Werkzeugs oder eines EB-Formationssystems wird jedoch bevorzugt, um hiPSC-Klumpen einheitlicher Größe herzustellen.
- An Tag 1 aspirieren Sie verbrauchte Medien und ersetzen Sie sie durch 20 ml frisches OP9-Medium. hiPS-Klumpen, die 1 Tag lang auf OP9/DLL1 cokultiviert wurden, erscheinen als kleine runde Monolayer-Kolonien (Abbildung 1).
- An Tag 5 aspirieren Sie 10 mL verbrauchtes Medium und fügen Sie 10 mL frisches OP9-Medium hinzu. Die hiPSC-Kolonien beginnen sich in primitive Mesoderme zu differenzieren, die durch ein mehrschichtiges dunkles Zentrum gekennzeichnet sind.
- An Tag 9 aspirieren Sie 10 ml verbrauchtes Medium und fügen Sie 10 ml frisches OP9-Medium hinzu. An diesem Punkt entwickeln sich mehrschichtige Zentrumsstrukturen zu kuppelartigen Formen, und ein peripherer netzwerkartiger Bereich wird sichtbar.
- An Tag 13 werden hämatopoetische Vorläuferzellen (HPCs) entnommen (Abbildung 1). Die von hiPSCs abgeleiteten Strukturen an Tag 13 zeichnen sich durch ein dunkles zentrales Organoid aus, das von einem Netzwerk kuppelartiger Bereiche umgeben ist, die für hämatopoetische Zonen (HZs) repräsentativ sind, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie aus menschlichen embryonalen Stammzellen stammende hämatopoetische Vorläuferzellen einschließen.
HINWEIS: Das Vorhandensein der kuppelartigen Strukturen deutet auf einen erfolgreichen Prozess hin, auch wenn keine dunklen Zentren vorhanden sind. Die Unfähigkeit, HPCs zu produzieren, kann auf die schlechte Qualität von OP9/DLL1, die Qualität der FBS-Charge, die Konfluenz von iPSC-Klumpen, die auf OP9/DLL1 ausgesät wurden (350-600 Klumpen sind optimal), und/oder Variationen in der Wirksamkeit von iPSC-Linien zur Produktion hämatopoetischer Vorläufer zurückzuführen sein.
- Aspirieren Sie verbrauchte Medien und waschen Sie sie 1x mit 5 mL 1x phenolrotfreier ausgewogener Salzlösung von Hanks, modifiziert mit Calcium und Magnesium (HBSS).
- Aspirieren Sie HBSS und fügen Sie 250 μl 5000 Einheiten/ml Kollagenase IV in 10 mL HBSS hinzu. Bei 37 °C 45 min inkubieren. HBSS mit Kollagenase IV aspirieren und einmal mit 5 mL PBS waschen.
- Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 5 ml 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu. Bei 37 °C 20 min inkubieren. Fügen Sie dann 4 ml OP9-Medium hinzu und dissoziieren Sie die Zellschicht durch Pipettieren, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird aspiriert und in 10 mL OP9-Medium resuspendiert.
- Plattenzellsuspension auf eine neue gelatinierte 10-cm-Zellkultur-Petrischale auftragen (siehe Schritte 3.1.1 und 3.1.2). Bei 37 °C 45 min inkubieren. Sammeln Sie dann nicht anhaftende Zellen durch vorsichtiges Pipettieren.
- Übertragen Sie die gesammelte Zellsuspension durch ein 100-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 10 mL Differenzierungsmedium [OP9-Medien mit 5 ng/ml humanem Stammzellfaktor (hSCF), 5 ng/ml humanem Flt3-Liganden (hFLT3L) und 5 ng/ml humanem Interleukin 7 (hIL-7)].
- Plattieren Sie die Zellsuspension auf eine neue 10 cm große OP9/DLL1-Konfluentenschüssel.
- Am 16. Tag passieren Sie die Zellen.
- Nicht adhärente Zellen durch schonendes Pipettieren mechanisch ablösen und durch ein 100 μm Zellsieb filtrieren. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird aspiriert und in einem 10-ml-Differenzierungsmedium resuspendiert.
- Plattieren Sie die Zellsuspension auf eine neue 10 cm große OP9/DLL1-Konfluentenschüssel.
- Setzen Sie die Passage von nicht adhärenten Zellen alle 5-7 Tage fort, indem Sie Schritt 3.8 wiederholen.
- An Tag 35 wird die CD4+CD8+ doppelt positive (DP) Population angereichert und die Produktion von CD8αβ+ einfach positiven (SP) T-Zellen stimuliert (Abbildung 2).
- Lösen Sie nicht adhärente Zellen mechanisch, indem Sie sie vorsichtig pipettieren und durch ein 100-μm-Zellsieb filtrieren, um Klumpen zu entfernen. Reichern Sie die CD4+-Zellpopulation durch CD4-Magnetbead-Isolierung gemäß dem Protokoll des Herstellers an.
Anmerkung: Der Grund für die Verwendung von CD4-Magnetbeads besteht darin, CD4-CD8-doppelt negative (DN) Zellen aus der Kultur zu entfernen, da diese nachweislich eine direkte Abtötung von CD4+CD8+ DP-Zellen nach der Stimulation verursachen.
- Zählen Sie lebende CD4-angereicherte Zellen mit einem Neubauer-Hämozytometer und Trypanblau-Farbstoff. In OP9-Medien in einer Gesamtkonzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml suspendieren. Aliquotieren Sie 1 ml der Zellsuspension (0,5 x 10,6 Zellen) in jede Vertiefung einer Gewebekultur mit flachem Boden und 24 gesunden Platten mit konfluentem OP9/DLL1.
- 100 I.E. humanes Interleukin 2 (hIL-2), 5 ng/ml hIL-7, 500 ng/ml anti-humaner CD3-Antikörper und 2 μg/ml anti-humaner CD28-Antikörper zugeben und bei 37 °C kultivieren.
