Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Zubereitung von Gliazell-Feeder-Gerichten (2 Wochen vor dem Kulturtag)
- Präparieren Sie die Rinde eines postnatalen, 1 Tag alten Mäusegehirns und schälen Sie die Hirnhäute ab.
- Zerkleinern Sie das Kortexgewebe so fein wie möglich mit einer sauberen Schere in einer sauberen Petrischale auf einer sauberen Bank.
- Übertragen Sie das gehackte Gewebe in 12 mL HBSS und fügen Sie 1,5 mL 2,5 % Trypsin und 1 % (wt/vol) DNase hinzu. In einem 37 °C warmen Wasserbad 15 min inkubieren, alle 5 min schwenken. Gut verdaulich Gewebe wird klebrig und bildet eine große Ansammlung. Triturieren Sie 10-15 Mal mit einer 10-ml-Pipette, um das Gewebe aufzubrechen und eine bessere Verdauung zu erzielen.
- Zerreiben Sie das gut verdaute Gewebe 10-15 Mal mit einer 5-ml-Pipette, bis die meisten Brocken verschwunden sind und das Medium trüb wird. Passieren Sie ein Zellsieb, um verbleibende Stücke zu entfernen, und fügen Sie 15 ml Gliamedium hinzu (Minimal essentielles Medium (MEM), ergänzt mit Glukose (0,6 % wt/vol), 10 % (vol/vol) Pferdeserum und Penicillin-Streptomycin (1x), um die Verdauung zu stoppen.
- Die Zellen werden bei 120 x g 5 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand aspiriert. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit frischem Gliamedium und Samen in Zellkulturschalen (ca. 105 Zellen/cm2 ).
- Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch frisches Glia-Medium, um nicht gebundene Zellen zu entfernen.
- Füttern Sie die Glia-Gerichte alle 3-4 Tage mit frischem Glia-Medium. Schlagen Sie 5-10 Mal mit der Hand auf den Kolben, um lose anhaftende Zellen zu lösen, bevor Sie das Medium wechseln.
- Nach 10 Tagen Kultur sollten die Gliazellen nahezu konfluent sein. Gliazellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA ablösen und etwa 105 Zellen in eine neue 60-mm-Zellkulturschale säen. Die restlichen Zellen könnten für die zukünftige Verwendung eingefroren werden.
- 3 Tage vor dem Kulturtag das Gliamedium auf neuronales Kulturmedium umstellen (Neurobasal-A Medium mit 1x GlutaMAX-I und 1x B27 Supplement)
>2. Kultur hippokampale Neuronen
HINWEIS: Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Präparieren Sie 6-8 Hippocampi von postnatalen 1 Tag alten Jungtieren von ANK3-E22/23f/f-Mäusen mit HBSS-Medium in einer Petrischale bei Raumtemperatur. Die Hippocampi mit einer Sezierschere in kleinere Stücke schneiden. Hippocampi aus der Petrischale in ein 15-ml-Röhrchen übertragen.
- Waschen Sie hippocampi 2x mit 5 mL HBSS in der Tube. Lassen Sie den Hippocampi nach dem Waschen in 4,5 ml 1x HBSS.
- 0,5 ml 2,5 % Trypsin in 4,5 ml HBSS geben und 15 Minuten in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubieren. Drehen Sie den Schlauch alle 5 Minuten um. Gut verdaute Hippocampi sollten klebrig werden und eine Traube bilden. Verlängern Sie bei Bedarf den Aufschluss um weitere 5 Minuten.
- Hippocampi 3 Mal für je 5 Minuten mit HBSS waschen. Verwenden Sie kein Vakuum, um das HBSS zu entfernen. Es ist sehr einfach, die Hippocampi zu entfernen.
- Fügen Sie nach dem Waschen 2 mL HBSS hinzu und pipettieren Sie die Hippocampi mit einer Pasteur-Pipette 15 Mal auf und ab.
- Zerreiben Sie das Gewebe mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette (der Durchmesser der Öffnung wird um die Hälfte verengt) 10 Mal. Gehen Sie nicht länger als 10 Mal, auch wenn noch Blöcke übrig sind. Überscherung tötet Neuronen.
- Lassen Sie das Rohr 5 Minuten ruhen, bis alle Brocken am Boden abgesetzt sind. Verwenden Sie vorsichtig eine 1-ml-Pipettenspitze, um den Überstand mit den dissoziierten Neuronen in die Plattschalen (10,5 Zellen/60 mm) zu übertragen. Geben Sie es direkt in das vorinkubierte Beschichtungsmedium und schütteln Sie die Platte vorsichtig.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.7 mit den restlichen Blöcken, bis die meisten Blöcke verschwunden sind.
- 2-4 Stunden nach der Aussaat die Plattierungsschalen mit einem Lichtmikroskop überprüfen. Die Mehrzahl der Neuronen sollte sich an das Deckglas anheftet haben. Die anhaftenden Zellen sind rund und hell. Drehen Sie Deckgläser mit einer feinen Spitze auf die Gliazell-Feederschalen mit vorkonditioniertem neuronalem Kulturmedium um, wobei die Wachspunkte mit der Seite nach unten zeigen.
- Neuronen können bis zu 1 Monat lang in den Gliazell-Feeder-Schalen wachsen. Füttern Sie die Neuronen alle 7 Tage mit 1 ml frischem neuronalem Kulturmedium.
- Optionaler Schritt: 1 Woche nach der Aussaat Cytosin-Arabosid (1-β-D-Arabinofuranosylcytosin) in eine Endkonzentration von 5 μM geben, um die Gliaproliferation einzudämmen.
