Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Beschichtung von Blechen
- Eine 96-Well-Mikroplatte mit Poly-L-Lysin (1 mg/ml, verdünnt in 0,1 M Boratpuffer [pH: 8,5]; 100 μl/Well) beschichten und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
Anmerkung: Beschichten Sie nur die Vertiefungen, die verwendet werden müssen. In den hier durchgeführten Experimenten werden die mittleren 60 Vertiefungen verwendet. Der Boratpuffer wird durch Mischen von 50 mM Borsäure und 12 mM Borat in sterilisiertem Wasser hergestellt.
- Waschen Sie die Platte zweimal mit sterilisiertem Wasser (250 μL/Well).
- Waschen Sie die Platte einmal mit frischem Nährmedium ohne Zusätze (250 μl/Well).
- Trocknen Sie die Platte 20 Minuten lang auf einer sauberen Bank.
- Wickeln Sie die Platte mit Alufolie ein und bewahren Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C auf (gültig für 1 Monat).
>2. Zell-Seeding
- Geben Sie 50 μl/Vertiefung des Nährmediums in die beschichtete Platte und bewahren Sie es 30 min bis 1 h in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator auf. Füllen Sie die peripheren Vertiefungen mit sterilisiertem Wasser (200 μl/Vertiefung).
Anmerkung: Das Kulturmedium wird hergestellt, indem dem neurobasalen Medium 50x B-27, 400x Glutamax und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin zugesetzt werden (Einzelheiten finden Sie in der Materialtabelle).
- Entfernen Sie das Kryofläschchen des Neurons aus dem Flüssigstickstofftank. Bei den hier verwendeten Neuronen handelte es sich um Dimethylsulfoxid-kryokonservierte (DMSO-kryokonservierte) Neuronen.
- Tauchen Sie das Kryofläschchen bis zu 37 °C in einen 37 °C heißen Heizblock und tauen Sie den Inhalt teilweise auf. Erwärmen Sie das Kryofläschchen nicht zu lange. Füllen Sie den Inhalt in ein 50-ml-Röhrchen, sobald es aufgetaut ist.
- Übertragen Sie den kryoplastischen Inhalt des Neurons langsam tropfenweise (50 μl/s) in ein steriles 50-ml-Röhrchen mit einer 1-ml-Pipette mit einer breitporigen Spitze.
- Spülen Sie das leere Kryoröhrchen mit 1 mL des Kulturmediums (Raumtemperatur; RT). Übertragen Sie diese 1 ml des Kulturmediums tropfenweise (50 μl/s) aus dem Kryofläschchen in das 50-ml-Röhrchen, das die Zellsuspension enthält.
- Geben Sie 9 ml des Nährmediums (RT) tropfenweise (0,5 ml/s) in das 50-ml-Röhrchen und füllen Sie das Volumen auf 11 ml auf. Wiederholen Sie das Pipettieren nicht, sondern mischen Sie die Zellsuspension langsam.
- Zählen Sie die Zellzahl (verwenden Sie einen Zellzähler oder ein Hämozytometer).
- Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein Reservoir und geben Sie die Zellsuspension mit einer Mehrkanalpipette mit breitporigen Spitzen (1,0 x 10,4 Zellen/Well) auf die 96-Well-Platte. Um die Verdunstung des Kulturmediums zu verringern, füllen Sie die peripheren Vertiefungen mit sterilisiertem Wasser (Schritt 2.1).
Anmerkung: Diese Studie bestätigt, dass die Verdunstung des Nährmediums für eine 3-wöchige Kultur ohne Medienaustausch gering ist. Die Reduktionsrate des Mediums beträgt 3,6 % (n = 120 Wells). Somit wird die Osmolalitätsänderung während der 3-wöchigen Inkubationszeit nicht drastisch sein.
- Inkubieren Sie die Neuronen für 1-2 h in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2.
- Ersetzen Sie das Kulturmedium durch 100 μl vorgewärmtes Kulturmedium (37 °C) pro Vertiefung und stellen Sie es wieder in einen 37 °Cund 5 % CO 2 -Inkubator (während der Kultur ist kein Medienwechsel erforderlich).
