Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Beschichten von Glasdeckgläsern mit Poly-L-Lysin
- Bereiten Sie Glasdeckgläser vor, indem Sie ein 5-ml-Aliquot von 200 μg/ml Poly-L-Lysin (PLL)-Lösung auftauen. Verdünnen Sie diese Stammlösung auf 20 μg/ml, indem Sie 45 ml reines Wasser in Injektionsqualität hinzufügen. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem Filter in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen. Beschriften Sie dieses Röhrchen als "PLL steril".
Anmerkung: Verwenden Sie bei Raumtemperatur gelagertes Wasser, um den Auftauvorgang zu beschleunigen.
- Geben Sie 100 sterile, runde 12-mm-Glasdeckgläser in die sterile PLL-Lösung. Rühren Sie das Rohr alle 5–10 Minuten für 2–3 Minuten, um eine gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten. Beschichten Sie die Deckgläser auf diese Weise für 1 h.
Anmerkung: In Deutschland hergestellte runde Glasdeckgläser (Durchmesser = 12 mm) werden bevorzugt, da sie eine zuverlässige Kulturoberfläche bieten und problemlos in die Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte passen.
- Nehmen Sie nach 40 Minuten PLL-Beschichtung 2 Stücke Seidenpapier und legen Sie sie flach in den Durchflussschrank. Sterilisieren Sie das Papier mit 70 % Ethanol, glätten Sie es dann, um Falten zu entfernen, und lassen Sie es trocknen.
- Nachdem Sie die Glasdeckgläser 1 h lang mit PLL beschichtet haben, entfernen Sie überschüssige PLL-Lösung und fügen Sie steriles Wasser in Injektionsqualität hinzu. Bewegen Sie die Deckgläser vorsichtig für 2–3 s, um das Entfernen von überschüssigem PLL zu ermöglichen. Wiederholen Sie diesen Spülschritt 2 weitere Male.
- Entfernen Sie überschüssiges Wasser und übertragen Sie dann die Deckgläser auf das sterile Seidenpapier. Jedes Deckglas mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig trennen und trocknen lassen.
Anmerkung: Deckgläser, die sich nicht leicht trennen lassen, können entsorgt werden. Alternativ kann eine kleine Menge Wasser hinzugefügt werden, um die Trennung zu erleichtern.
- Nach dem Trocknen die Deckgläser auf eine 24-Well-Kulturplatte geben.
Anmerkung: Deckgläser sollten ca. 30 min–1 h vor Beginn des Präpariervorgangs vorbereitet werden. Die Platten können in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gelagert werden, bis sie benötigt werden.
>2. Dissoziation von hippokampalem und kortikalem Gewebe
- Herstellung von Zellkulturlösungen
- Für die Dissoziation von Nervengewebe taut man zunächst ein 40 mL Aliquot Zellkulturpuffer auf (Zusammensetzung [in mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2PO4, 1 MgSO4·7H2O, 1 CaCl2·2H2O, 0,5 EDTA·2Na·2H2O und 25 D-Glukose, pH = 7,4). Messen Sie 12 ml Zellkulturpuffer in ein konisches 15-ml-Röhrchen ab. als "BSA" gekennzeichnet. Messen Sie 5 ml Zellkulturpuffer in ein anderes 15-ml-Röhrchen ab. Etikett als "Papain". Inkubieren Sie beide Röhrchen 15 Minuten lang bei 37 °C in einem Wasserbad.
- Den restlichen Zellkulturpuffer filtrieren, als "Puffer - Steril" kennzeichnen und bis zur Anforderung bei 4 °C lagern.
- Wiegen Sie 120 mg Rinderserumalbumin (BSA) ab und geben Sie es in das Röhrchen mit der Aufschrift "BSA". Wiegen Sie 7 mg Papain ab und geben Sie es in die Tube mit der Aufschrift "Papain". Beide Röhren für 15 Min. wieder ins Wasserbad stellen
Anmerkung: Es ist hilfreich, eine kleine Menge Puffer in die Waage zu geben, um den Transfer des Papainpulvers zu erleichtern.
- Sobald sich alle Pulver aufgelöst haben, filtrieren Sie jede Lösung in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen. Bei Tuben-Papain ist die filtrierte Lösung als "Papain - Steril" zu kennzeichnen. Für Röhrchen-BSA teilen Sie die sterile BSA-Lösung in 3 Röhrchen auf, die jeweils 4 mL BSA-Lösung enthalten. Beschriften Sie jedes Röhrchen mit "BSA - Steril" und entweder "1", "2" oder "3". Alle Röhrchen wieder in das Wasserbad stellen und bis zur Anforderung bei 37 °C weiter inkubieren.
- Vorbereitung für die Gewebedissektion
- Nehmen Sie ein einzelnes Stück 35 mm Filterpapier (siehe Materialtabelle) und sterilisieren Sie es mit 70 % Ethanol und lassen Sie es im Deckel einer 100 mm Petrischale in einem Durchflussschrank trocknen. Legen Sie die Schere, die Pinzette, das Skalpell und den Spatel (siehe Materialtabelle) aus, die für die Dissektion des Hippocampus und des Kortex erforderlich sind.
- Stellen Sie zwei 35-mm-Petrischalen und eine 100-mm-Petrischale mit sterilem Filterpapier an einer zugänglichen Stelle in der Mitte des Durchflussschranks auf.
- Sammeln Sie transgenes NexCre; Ai9 und VGAT Venus-Maus-Welpen, die präpariert werden sollen. Verwenden Sie eine Leuchtstofflampe mit geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern (siehe Materialtabelle), um fluoreszierende Jungtiere von Wildtyp-Wurfgeschwistern zu unterscheiden.
- Unmittelbar vor dem Präparieren der Tiere ist jede 35-mm-Petrischale mit gekühltem, sterilem Zellkulturpuffer zu befüllen.
Anmerkung: Eine Petrischale dient zum Reinigen der Werkzeuge zwischen den Dissektionen, die andere zum Sammeln des Hippocampus und des Kortex.
- Dissektion von Gewebe
- Sobald der Zellkulturpuffer eingegossen ist, enthaupten Sie ein transgenes Maus- oder Rattenbaby nach der Geburt mit einer großen, scharfen Schere und verwenden Sie eine sterile 100-mm-Petrischale, um den Kopf in den Durchflussschrank zu überführen. Verwenden Sie eine Pinzette, eine Schere und einen Spatel, um das Gehirn eines transgenen Welpen vorsichtig auf steriles Filterpapier zu übertragen.
- Verwenden Sie ein Skalpell vom Typ 22, um das Kleinhirn zu präparieren und die 2 Hemisphären zu trennen. Mit einem kleinen Spatel die Halbkugeln seitlich rollen. Drücken Sie auf jede Halbkugel leicht nach unten, so dass die Rinde mit dem Filterpapier in Berührung kommt. Bewegen Sie sanft die Regionen des Mittelhirns, um den Hippocampus und den Kortex freizulegen.
Anmerkung: Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auszuüben, wenn Sie auf die Halbkugeln drücken, da sonst die Zellen zerquetscht werden können.
- Verwenden Sie ein Skalpell oder einen Spatel, um den Hippocampus und den Kortex von jeder Hemisphäre zu trennen. Übertragen Sie das präparierte Gewebe in eine 35-mm-Petrischale, die gekühlten Zellkulturpuffer enthält.
Anmerkung: Wenn Sie mehrere Tiere präparieren, lagern Sie den sterilen Zellkulturpuffer in einem konischen 50-ml-Röhrchen auf Eis. Nach jeder Dissektion wird das präparierte Gewebe in den gekühlten Zellkulturpuffer überführt.
- Nach erfolgreicher Dissektion des Kortiko-Hippocampus-Gewebes wird die sterile Papainlösung aus dem Wasserbad in den Durchflussschrank überführt. Verwenden Sie eine 3-ml-Pasteur-Pipette, um den präparierten Hippocampus und die Hirnrinde auf den Deckel einer sterilen 35-mm-Petrischale zu übertragen. Mit dem flachen Teil eines Skalpells vom Typ 22 kreuz und quer hacken, bis das Gewebe in kleine Stücke zerlegt ist.
- Verwenden Sie eine kleine Menge Papainlösung, um das gehackte Gewebe vom Deckel der Petrischale in das sterile Papain-Röhrchen zu übertragen. Stellen Sie die Papain-Sonde wieder in das Wasserbad und inkubieren Sie das Gewebe bei 37 °C für 25 min.
- Während der Papain-Inkubation stellen Sie eine vollständige Fluoreszenzmedienlösung her. Tauen Sie ein 1-ml-Aliquot von B27, ein 0,5-ml-Aliquot von Glutamax und ein 0,5-ml-Aliquot von Pen-Strepto-Partikeln auf. Aliquotieren Sie 48,5 mL Hibernate A Medium mit niedriger Fluoreszenz auf ein konisches 50-ml-Röhrchen. B27, Glutamax und Pen-Strep zur Lösung geben. Schütteln Sie die Lösung gut, sterilisieren Sie sie dann und beschriften Sie sie mit "Hibernate A complete media" (mit Datum und Initialen). Bei 37 °C im Wasserbad inkubieren.
- Nach der Papain-Inkubation werden die Papain-Sonde und die sterilen BSA-Röhrchen in den Durchflussschrank überführt. Verwenden Sie eine 1 mL Pasteurpipette, um nur das Kortiko-Hippocampus-Gewebe aus dem Papain-Röhrchen in das BSA-Röhrchen 1,
zu entnehmen
Anmerkung: Achten Sie darauf, die Übertragung von überschüssiger Papainlösung zu minimieren.
- Dissoziation der Zellen
- Um große Gewebeklumpen aufzubrechen, zerreiben Sie das Gewebe mehrmals mit einer 1 mL Pasteur-Pipette. Anschließend das Gewebe mit einer Pasteurpipette mit feiner Spitze 7 Mal verreiben. Lassen Sie das Gewebe 30 s lang stehen, damit größere Gewebestücke sedimentieren können.
- Übertragen Sie nach 30 s die unteren 1 ml Lösung und Gewebe von BSA-Röhrchen 1 in BSA-Röhrchen 2. Zerreiben Sie das Gewebe im BSA-Röhrchen 2 mehrmals mit einer Pasteurpipette mit feiner Spitze.
- Nach der Verreibung werden die unteren 1 mL Gewebe und Lösung erneut aus dem BSA-Röhrchen 1 übertragen, nun aber in das BSA-Röhrchen 3. Zerreiben Sie das Gewebe im BSA-Röhrchen 3 mehrmals mit einer Pasteurpipette mit feiner Spitze.
- Nach der Verreibung die gesamte Lösung und das Gewebe aus den Röhrchen 2 und 3 in das BSA-Rohr 1 überführen. Weitere 2-3 Mal zerreiben und bei 3.000 x g für 3 min zentrifugieren.
- Während der Zentrifugation wird das komplette Neural Basal A media (NBA media) gebildet. Aliquotieren Sie 48,5 mL NBA-Medium in ein konisches 50-ml-Röhrchen und inkubieren Sie es bei 37 °C in einem Wasserbad. Beschriften Sie diese Tube mit "NBA only". Tauen Sie außerdem ein 1 mL Aliquot von B27, ein 0,5 mL Aliquot von Glutamax und ein 0,5 mL Aliquot von Pen-Strep bei Raumtemperatur auf.
- Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand aus dem pelletierten Gewebe und suspendieren Sie die Zellen erneut in 2 ml vollständigem Medium. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das Gewebe 20 Mal auf und ab zu reiben.
Anmerkung: Achten Sie darauf, die Zellen nicht zu stark zu pipettieren. Wenn zu viel Druck ausgeübt wird, können die Zellen beschädigt werden.
- Verwenden Sie eine 1-ml-Pasteurpipette, um die Zellsuspension durch ein 30-μm-Zellsieb in ein Probenröhrchen aus Polystyrol zu filtrieren.
Anmerkung: Wenn die Zellsuspension nicht sofort durch das Zellsieb gelangt, kann es erforderlich sein, mit einem sterilen Handschuh auf das Sieb zu drücken, um den Fluss zu starten. Dieser wichtige Schritt verhindert ein Verstopfen des Zellsortierers.
- Bereiten Sie zum Sammeln von Neuronen nach dem Sortieren Entnahmeröhrchen vor, indem Sie 300 μl des vollständigen Mediums auf die erforderliche Anzahl von Polypropylenröhrchen pipettieren.
- Die Zellsuspension ist nun bereit, um zur Sortierung in den Zellsortierer gebracht zu werden. Nehmen Sie die Zellsuspension, zusätzliche Sammelröhrchen und das komplette Ersatzmedium für den Fall, dass eine Verdünnung der Probe erforderlich ist.
>3. Zellsortierung von gereinigten GABAergen oder glutamatergen Neuronen
HINWEIS: Um die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen Kontamination während der Sortierung zu minimieren, spülen Sie den Probenschlauch des Sortierers mindestens 5 Minuten lang mit 70% Ethanol aus. Die detaillierten Sortierparameter variieren je nach Instrument, grundlegende Überlegungen sind wie folgt.
- Während der ersten Zellsortierung bestimmen Sie die Hintergrundfluoreszenz von unmarkierten Zellen, indem Sie Zellen eines Wildtyp-Tieres sortieren und vergleichen.
- Wählen Sie für jeden zu sortierenden Fluoreszenzzelltyp die passenden Anregungs- und Emissionsfilter. Anregung von Venus- und TdTomato-Proteinen mit Anregungswellenlängen von 488 nm bzw. 531 nm. Erkennen Sie emittiertes Licht durch 530/40- bzw. 575/30-Emissionsfiltersätze.
- Geben Sie Polypropylen-Sammelröhrchen mit 300 μl vollständigem Medium in den Zellsortierer für die Zellentnahme.
- Für eine hohe Reinheit sortieren Sie hell markierte fluoreszierende Zellen (siehe Abbildung 1B für z. B. Punktdiagramme von sortierten Zellen).
- Führen Sie nach dem Sortieren einen Reinheitstest der sortierten Zellen durch, um den Reinheitsgrad zu schätzen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Beachten Sie, dass die typische Wiederfindungsrate von Zellen nach der Sortierung zwischen 70 und 80 % liegt.
- Notieren Sie sich die Anzahl der Zellen, die in jedem Sammelröhrchen sortiert sind. Dieser Wert wird vom Zellsortiergerät angegeben.
Anmerkung: Die Zellsortierung kann mit einer 70-μm-Düse (70 psi Mantelflüssigkeitsdruck) oder einer 100 μm-Düse (20 psi Mantelflüssigkeitsdruck) durchgeführt werden.
>4. Kultivierung sortierter Neuronen
- Nach der Zellsortierung werden die gesammelten Zellen mit einer 1-ml-Pasteurpipette in 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden überführt. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 3.000 x g für 3 min zu einem Zellpellet.
Anmerkung: Um die Position des Zellpellets zu identifizieren, richten Sie die Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden so aus, dass das Scharnier des Deckels nach außen zeigt, wodurch sich das Zellpellet auf der Rückseite des Zentrifugenröhrchens bilden kann (d. h. auf der gleichen Seite des Rohrs wie das Scharnier).
- Fügen Sie während der Zentrifugation 1 ml B27, 0,5 ml Glutamax und 0,5 ml Pen-Strep zu den 48,5 ml vorgewärmten NBA-Medien hinzu. Die Lösung gut schütteln, dann filtrieren, sterilisieren und als "NBA complete media" (mit Datum und Initialen) beschriften. Kehren Sie zum Wasserbad zurück, bis es benötigt wird.
- Nach der Zentrifugation ist der Überstand mit einer 1-ml-Pasteurpipette in ein anderes Zentrifugenröhrchen zu überführen (den Überstand für den Fall einer Störung des Zellpellets aufbewahren). Suspendieren Sie das Zellpellet in der erforderlichen Menge an vorgewärmtem NBA-Medium, um eine Zelldichte von 1.000 Zellen/μl zu erreichen. Suspendieren Sie die Zellen erneut, indem Sie mit einer P200- oder P1000-Pipette auf und ab pipettieren.
- Um das Vorhandensein von dissoziierten Zellen zu bestätigen, überprüfen Sie die Zelllösung unter einem Mikroskop mit einer 4x- oder 10x-Objektivlinse. Alternativ können Sie eine kleine Menge Zelllösung auf ein Deckglas pipettieren und unter dem Mikroskop überprüfen. Sind viele Zellen vorhanden, kann der Überstand aus Schritt 4.3 verworfen werden.
- Vor dem Plattieren der Zellen 2–3 s bei mittlerer Geschwindigkeit vortexen, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. Pipettieren Sie nach dem Vortexen schnell 10 μl der Zellsuspension in die Mitte jedes Deckglases. Nach dem Pipettieren der Zellen jede Platte schnell wieder in den Inkubator (5 % CO2/37 °C) stellen und 1 h.
inkubieren
Anmerkung: Wenn Sie Zellen zu mehreren 24-Well-Platten hinzufügen, stellen Sie eine gleichmäßige Zelldichte sicher, indem Sie die Zellen zwischen den Platten vortexen.
- Nach 1 h füttern Sie die Zellen mit 500 μL vorgewärmtem NBA-Komplettmedium und kehren Sie in den Inkubator zurück.
Anmerkung: Bei der Fütterung der Zellen ist es wichtig, das Medium vorsichtig an der Seite der Vertiefung hinunter zu pipettieren, um eine Zellablösung zu vermeiden. Für kurze Experimente (<16 Tage) ist eine Fütterung bei der oben genannten Dichte nicht erforderlich. Bei der Beschichtung einer größeren Zelldichte können häufigere Fressintervalle erforderlich sein.
