>1. Vorbereitung der Medien
HINWEIS: Das Protokoll basiert auf einer Mischung aus zwei separaten Medien: DMEM/F12 ergänzt mit modifiziertem N2-Supplement und Neurobasal ergänzt mit B27-Supplement, typischerweise in einem Verhältnis von 1:1.
- Bereiten Sie das modifizierte N2-Präparat vor, indem Sie die Komponenten in einer 15-ml-Tube mischen. Wirbeln oder filtern Sie dies nicht; Mischen Sie, indem Sie das Röhrchen umdrehen, bis die Lösung klar ist.
- Beginnen Sie mit dem Pipettieren von 7,2 ml DMEM/F12, fügen Sie dann 1 ml 25 mg/ml Insulin (bestehend aus 0,01 M HCl) hinzu und mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen umdrehen. Es dauert ein paar Minuten, bis die Lösung klar ist.
- 1 ml 100 mg/ml Apo-Transferrin (in Wasser hergestellt), 33 μl 0,6 mg/ml Progesternon (in Ethanol hergestellt), 100 μl 160 mg/ml (1 M) Putrescin (in Wasser hergestellt), 10 μl 3 mM Natriumselenit (in Wasser hergestellt) und 666 μl 7,5 % Rinderserumalbumin zugeben und das Röhrchen gut mischen. Aliquot in 2,5 ml und bis zu 2 Monate bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie die Medien vor.
- Zu 250 ml DMEM/F12 werden 2,5 ml N2 gegeben. Gut mischen, aber nicht schütteln oder filtrieren.
- Zu 250 ml Neurobasalmedien fügen Sie 5 ml B27-Präparat hinzu. Gut mischen, aber nicht schütteln oder filtrieren.
- Mischen Sie die Medien aus den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 im Verhältnis 1:1. In einigen Fällen kann eine 1:3-Mischung erforderlich sein (ergänzt als 1:1-Mischung in Schritt 1.2.4).
- Zu der Mischung 0,5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 0,2 mM) und 3,5 μl 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration 0,1 mM) geben und ohne Schütteln gut mischen. Lagern Sie das Medium bis zu 3 Wochen bei 4 °C und vermeiden Sie es, es Licht auszusetzen. Dieser finale Mix wird als N2B27 bezeichnet.
- Bereite die Gelatinelösung vor.
- Bereiten Sie eine 1%ige Gelatinelösung in Reinstwasser vor und autoklavieren Sie sie 15 Minuten lang bei 121 °C, 15 psi. Es ist wichtig, dass die dafür verwendete Flasche vollständig von Reinigungs- oder Desinfektionsmitteln gereinigt ist, daher wird empfohlen, dafür eine neue Flasche zu verwenden und zwischen den Anwendungen immer nur mit Reinstwasser zu spülen. Die 1%ige Lösung in 50 ml Aliquote aliquotieren und monatelang bei 4 °C aufbewahren.
- Ein Aliquot von 1 % Gelatine in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen, bis es sich aufgelöst hat, und zu 500 ml warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) geben. Gut mischen und so weit pipettieren, dass der Boden jeder Vertiefung oder Platte bedeckt ist. Lassen Sie die Gelatine die Oberfläche mindestens 30 Minuten lang einwirken.
>2. Plattieren der Zellen
HINWEIS: Dieses Protokoll gilt gleichermaßen für Maus-ESC, die in 10% Serum mit Leukämie-Hemmfaktor (LIF) gezüchtet wurden, Serumersatz mit LIF oder serumfreien Medien mit LIF und knochenmorphogenetischem Protein 4 (BMP4) oder MEK- und GSK3-Inhibitoren (2i-Medien) mit oder ohne LIF. Der Zeitpunkt und die Effizienz der Differenzierung können jedoch je nach Medium und Zellen variieren. Für die hier gezeigten Experimente haben wir die 46C-Maus-ESC-Linie (mit einem EGFP-Reporter, der in eines der endogenen Sox1-Allele geknockt wurde) verwendet, die in GMEM mit 10% Serum und LIF gezüchtet wurde. Für optimale Ergebnisse ist es wichtig, dass die Zellen dissoziiert und in den N2B27-Medien neu plattiert werden. Ein einfacher Wechsel des Mediums von GMEM/Serum/LIF auf N2B27 führt immer zu einer reduzierten Differenzierungseffizienz im Vergleich zur Neubeschichtung der Zellen.
- Züchten Sie die Zellen in GMEM mit 10 % Serum, 1 mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 M 2-Mercaptoethanol und 100 Einheiten/ml LIF13. Um eine subkonfluente Kultur von Maus-ESC zu erhalten, werden 1 x 106 Zellen in einen T25-Kulturkolben gegeben, was 2 - 3 Tage dauert.
- Beobachten Sie Zellen unter einem Hellfeldmikroskop. Wenn die Zellen subkonfluent und bereit für die Passage sind, spülen Sie sie zweimal in PBS. Geben Sie 1 ml Zelldissoziationsreagenz hinzu und kehren Sie für 2 - 5 Minuten in den Inkubator zurück. Obwohl Trypsin und andere Enzyme auch für die Zelldissoziation verwendet werden können, können sie sich negativ auf die Zelladhäsion auswirken, so dass die Plattierungsdichten angepasst werden müssen.
- Sobald sich die Zellen von der Platte zu heben beginnen, klopfen Sie auf das Gefäß, um sie in eine Einzelzellsuspension zu verdrängen. Sammeln Sie die Zellen in 10 ml Medium und Zelldissoziationsreagenz und pipetieren Sie sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Die Zellen bei 300 x g für 3 min bei RT drehen.
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml vorgewärmtem N2B27, indem Sie es 3 - 5 Mal auf und ab pipettieren. Wenn Sie die Suspension nach unten pipettieren, pipetieren Sie gegen die Seite des Röhrchens, um Blasenbildung zu vermeiden. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer und erfassen Sie die Konzentration.
- Bereiten Sie eine Zellsuspension vor, die die gewünschte Anzahl von Zellen pro Volumeneinheit enthält, die pro Vertiefung in vorgewärmtem N2B27 plattiert werden sollen. Eine Dichte von 10.500 Zellen procm2 in einer 6-Well-Schale (d. h. 1 x 105 Zellen pro Well einer 6-Well-Schale) ist optimal. In Tabelle 1 finden Sie die empfohlene Anzahl von Zellen pro cm2 und das Volumen der Galvanikmedien für verschiedene Zellkulturgefäße.
- Aspirieren Sie die Gelatine aus dem Kulturgefäß und plattieren Sie die Zellsuspension gemäß der in Tabelle 1 empfohlenen Dichte und dem empfohlenen Volumen. Schwenken Sie die Platten nicht, da dies die Zellen zur Mitte hin konzentriert. Die Kulturen werden in einen feuchten Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 gestellt.
- Wechseln Sie das Medium alle 1 - 2 Tage, indem Sie alle Medien durch frisches N2B27 ersetzen. Pipettieren Sie vorsichtig, da das Spülen der Zellen die Dichte beeinträchtigen und die Differenzierungseffizienz in den folgenden Tagen verringern kann. Wenn die anfängliche Lebensfähigkeit nach dem Plattieren schlecht ist, plattieren Sie die Zellen in einer 1:3-Mischung aus den N2- und B27-supplementierten Medien und ändern Sie diese nach den ersten zwei Tagen auf N2B27. Die Zellen beginnen sich zu differenzieren und sollten innerhalb von 4 - 6 Tagen eine Sox1-Expression zeigen (sichtbar durch grüne Fluoreszenz des Reporters in der hier verwendeten 46C-Zelllinie).
Tabelle 1. Empfohlene Beschichtungsdichten und Medienvolumen für verschiedene Behältergrößen. Die Plattierungsdichten in dieser Tabelle wurden unter Verwendung der 46C-Zelllinie bestimmt. Für optimale Ergebnisse muss die Beschichtungsdichte jeder einzelnen Linie angepasst werden.
| Bahnsteig | Bereich der effektiven Dichte (Zellen/cm 2) | Bereich der Zellnummer bis zur Platte | Empfohlenes Anfangsvolumen des Mediums (μl) | Empfohlenes Medienvolumen nach Tag 1 (μl) |
| 6-Well-Platte | 10.500 - 36.500 | 99.750 - 346.750 | 1.000 | 2.000 |
| 24-Well-Platte | 15.600 - 46.800 | 29.640 - 88.920 | 500 | 1.000 |
| 96-Well-Platte | 103.500 - 260.000 | 33.120 - 83.200 | 100 | 200 |