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>1. HNSC-Differenzierung zur dreidimensionalen (3D) Kultur
HINWEIS: Isolierung und Ableitung menschlicher neuraler Stammzellen (hNSCs) aus einem ethisch zugelassenen Gewebe, das in einer früheren Veröffentlichung beschrieben wurde. Bitte befolgen Sie die ethischen und institutionellen Richtlinien, während Sie dieses Verfahren befolgen.
- 3D-Kultur mit 12-Well-Platte
- Verwenden Sie während des gesamten Eingriffs eine aseptische Technik. In einer biologischen Sicherheitswerkbank rehydrieren Sie Gerüste, indem Sie 2 ml/Vertiefung 70%iges Ethanol hinzufügen, das mit Wasser für die Bewässerung (WFIr) hergestellt wurde. Vermeiden Sie es, die Gerüste zu berühren, indem Sie das 70%ige Ethanol an der Wand jeder Vertiefung abgeben.
- Saugen Sie das 70%ige Ethanol vorsichtig an und waschen Sie die Gerüste sofort mit 2 ml/Well Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM: F12) für 1 min. Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal. Saugen Sie das DMEM: F12 nach der letzten Wäsche vorsichtig an.
- Gerüste durch Zugabe von 2 ml/Vertiefung Laminin (10 μg/ml) in DMEM: F12 beschichten. Die Platte bei 37 °C in einem mit 5 % CO2 befeuchteten Inkubator mindestens 2 Stunden lang inkubieren. Waschen Sie den Teller mit warmem DMEM: F12.
- Jedes Gerüst wird mit ca. 500.000 hNSCs in einem Volumen von 150 μl RMM+Wachstumsfaktoren (GFs) besiedelt.
- Inkubieren Sie die Platte 3 Stunden lang bei 37 °C in einem mit 5 % CO2 befeuchteten Inkubator, damit sich die Zellen in den Gerüsten ansiedeln können.
- Geben Sie 3,5 ml RMM in jede Vertiefung und achten Sie darauf, dass sich keine Zellen von den Gerüsten lösen.
- Inkubieren Sie die Platte 7 Tage lang; ersetzen Sie RMM medium (3,5 ml/Well) nach 1 Tag (erste Fütterung) und erneut 2-3 Tage nach der ersten Fütterung
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