Generierung postganglionärer sympathischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Wu, H. F., et al. Effiziente Differenzierung postganglionärer sympathischer Neuronen unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen unter Feeder-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video demonstriert eine in vitro Methode zur Erzeugung postganglionärer sympathischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). hPSCs werden auf einem Basalmembranmatrixträger unter Verwendung eines Differenzierungsmediums zu Neuralleistenzellen (NCCs) differenziert. Die NCCs werden dann dissoziiert und unter Verwendung eines anderen Differenzierungsmediums zu Sphäroiden geformt. Schließlich werden die Sphäroide mit Hilfe eines sympathischen Neuronenmediums in postganglionäre sympathische Neuronen umgewandelt.

Protokoll

>1. Aufbau für Schalenbeschichtung, Medienvorbereitung und hPSC-Wartung

1. Beschichtung der Schüssel
   1. Vitronectin (VTN)-Beschichtung
      1. Die Durchstechflaschen mit VTN in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen, bis sie vollständig aufgetaut sind, und dann gründlich mischen.
      2. Für eine 100-mm-Petrischale werden 7 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,5 mg/ml VTN gemischt, VTN-Lösung in die Schale gegeben und 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
   2. Beschichtung mit Basalmembran-Matrix
      1. Fläschchen mit Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) auf Eis bei 4 °C über Nacht auftauen.
      2. Mischen Sie für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte 2 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) mit 20 μl 100x Basalmembranmatrix, fügen Sie der Schale Basalmembranmatrixlösung hinzu, wickeln Sie die Schale mit Paraffinfolie ein und lagern Sie sie über Nacht in einem sauberen Behälter bei 4 °C. Arbeiten Sie so schnell wie möglich. Beschichtetes Geschirr kann bei 4 °C bis zu 2 Wochen gelagert werden.
   3. Polyornithin (PO)/Laminin (LM)/Fibronektin (FN) Beschichtung
      1. Mischen Sie am ersten Tag für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte 15 μg/ml PO mit 1 ml 1x PBS und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂. Sowohl LM als auch FN über Nacht bei -20 °C auftauen und bis zum vollständigen Auftauen bei 4 °C lagern.
      2. Am zweiten Tag die PO-Lösung aspirieren, die Vertiefungen 2x mit 1x PBS waschen, 1 ml 1x PBS mit 2 μg/ml LM und 2 μg/ml FN hinzufügen und über Nacht bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubieren. Zu diesem Zeitpunkt kann die Schale mit der LM/FN-Lösung monatelang im Inkubator aufbewahrt werden, solange sie nicht austrocknet. Füge mehr 1x PBS hinzu, um ein Austrocknen des Gerichts zu verhindern.
2. Vorbereitung der Medien
   1. Bereiten Sie das Essential 8 Medium (E8) zu, indem Sie eine Flasche E8-Präparat über Nacht bei 4 °C auftauen. Mischen Sie das Präparat mit 500 ml E8-Medium und bei Bedarf mit Antibiotika.
      Anmerkung: Die funktionierende E8-Lösung sollte innerhalb von 2 Wochen aufgebraucht werden.
   2. Bereiten Sie das hPSC-Gefriermedium vor, indem Sie 90 mL des vollständigen E8-Mediums mit 10 mL Dimethylsulfoxid (DMSO) mischen, um ein Gesamtvolumen von 100 mL zu erhalten. Filter sterilisieren.
   3. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium von Tag 0 bis Tag 1 vor, indem Sie 100 ml essentielles 6 (E6)-Medium mit 10 μM SB431542, 1 ng/ml knochenmorphogenetischem Protein 4 (BMP4), 300 nM CHIR99021 und 10 μM Y27632 für ein Gesamtvolumen von 100 ml mischen.
   4. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium für Tag 2 bis Tag 10 vor, indem Sie 100 mL E6-Medium mit 10 μM SB und 0,75 μM CHIR99021 mischen, um ein Gesamtvolumen von 100 mL zu erhalten.
   5. Bereiten Sie das Sphäroidmedium von Tag 10 bis Tag 14 vor, indem Sie neurobasales Medium mit 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 3 μM CHIR99021 und 10 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF2) für ein Gesamtvolumen von 100 mL mischen.
   6. Bereiten Sie das Medium für Tag 14 bis Tag 28 für die langfristige Sphäroiderhaltung vor, indem Sie 0,5 μM frische Retinsäure (RA) zu dem Sphäroidmedium von Tag 10 bis Tag 14 für jede Fütterung hinzufügen.
      Anmerkung: Halten Sie die RA immer bei -80 °C.
   7. Bereiten Sie das SymN-Reifungsmedium vor, indem Sie neurobasales Medium mit 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 25 ng/ml glia cell line derived neurotrophic factor (GDNF), 25 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF), 25 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF), 200 μM Ascorbinsäure und 0,2 mM Dibutyrylcyclisches Adenosinmonophosphat (dbcAMP) für ein Gesamtvolumen von 100 mL mischen. Die Lösung sollte innerhalb von 2 Wochen verwendet werden. Vor jeder Fütterung 0,125 μM frische RA zugeben. Diese Lösung wird ab Tag 14 (Option 1) oder Tag 28 (Option 2) verwendet.
   8. Bereiten Sie den Puffer für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) vor, indem Sie DMEM mit 2 % FBS, 2 mM L-Glutamat und Antibiotika mischen, falls erforderlich, um ein Gesamtvolumen von 100 mL zu erhalten.
3. hPSC-Wartung
   1. Auftauen und Aufbewahren von hPS-Zellen
      1. Bereiten Sie eine VTN-beschichtete 100-mm-Schale zu.
      2. Um ein Fläschchen mit hPSCs direkt aus flüssigem Stickstoff aufzutauen, stellen Sie das Fläschchen in ein 37 °C heißes Wasserbad und schwenken Sie den Schlauch vorsichtig im Wasser, bis er auftaut. Die aufgetauten hPS-Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml 1x PBS überführt und 4 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert.
      3. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 1 ml E8-Medium in das Röhrchen. Pipettieren Sie einige Male, um das Pellet vollständig zu resuspendieren, und fügen Sie dann weitere 9 ml E8-Medium hinzu, um insgesamt 10 mL zu erreichen.
      4. Die VTN-Lösung wird aus der 100-mm-Schüssel abgesaugt.
      5. Übertragen Sie die hPS-Zellen in eine 100-mm-Schale, schütteln Sie sie vorsichtig (oben-unten und links-rechts, nicht in Kreisen), um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig in der Schale verteilt sind.
      6. Inkubieren bei 37 °C in 5 % CO₂.
      7. Am nächsten Tag wird das gesamte Medium aspiriert und mit 10 ml E8 gefüttert.
      8. Füttern Sie auf diese Weise jeden Tag für die nächsten 3-4 Tage und bereiten Sie sich dann auf die Teilung vor.
   2. Aufteilen von hPSCs
      HINWEIS: hPSCs sollten zum Zeitpunkt der Spaltung zu 80 % bis 90 % konfluent sein. Große Kolonien mit glatten und hellen Kanten sollten beobachtet werden. Der Kontakt zwischen den einzelnen Kolonien sollte jedoch vermieden werden (Abbildung 1B, Tag 0 und Abbildung 4B).
      1. Bereiten Sie VTN-beschichtete 100-mm-Gerichte nach Bedarf zu.
      2. Saugen Sie den E8 an und spülen Sie das Geschirr, das geteilt werden soll, 1x mit 1x PBS ab.
      3. Aspirieren Sie das 1x PBS und fügen Sie 4 mL 0,25 M EDTA hinzu. 2 min bei 37 °C inkubieren, 5 % CO₂,
         Anmerkung: Die hPSCs sollten als kleine Kolonien gespalten/neu plattiert werden. Nicht länger als 2 Minuten mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) behandeln, um eine Trennung in einzelne Zellen zu verhindern. Die Zellen sollten auch nach der 2-minütigen Behandlung noch an der Oberfläche der Schale haften.
      4. Aspirieren Sie das EDTA, lösen Sie die Kolonien, indem Sie 10 ml E8-Medium kräftig auf die Oberfläche der Schale pipettieren, und sammeln Sie das gesamte Medium und die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen.
      5. Bei einer Konfluenz von 80 % bis 90 % teilen Sie die Kolonien um 1:15 bis 1:20 %. Um beispielsweise hPSCs im Verhältnis 1:20 in eine 100-mm-Schale aufzuteilen, nehmen Sie 500 μl E8/hPSCs-Lösung und mischen Sie sie mit 9,5 mL frischem E8-Medium.
      6. Platten-hPSCs in VTN-beschichteten 100-mm-Schalen.
         Anmerkung: Es wird empfohlen, das ideale Split-Verhältnis für jeden Forscher und jede Zelllinie unabhängig voneinander festzulegen.
   3. Einfrieren von hPS-Zellen
      1. Für eine 100-mm-Schale mit hPSCs, die gespalten werden kann, werden drei Kryoröhrchen und 3,5 ml Gefriermedium vorbereitet.
         HINWEIS: Medien und Durchstechflaschen sollten bis zur Verwendung bei 4 °C oder auf Eis aufbewahrt werden.
      2. E8 ansaugen und das Geschirr 2x mit 1x PBS spülen.
      3. 1x PBS aspirieren und 4 mL 0,25 M EDTA zugeben, 2 min bei 37 °C inkubieren, in 5 % CO₂,
         HINWEIS: hPSCs sollten zum Zeitpunkt der Teilung als kleine Kolonien eingefroren werden. Behandeln Sie die Zellen nicht länger als 2 Minuten mit EDTA, um eine Trennung in einzelne Zellen zu verhindern. Nach der 2-minütigen Behandlung sollten noch Zellen auf der Oberfläche der Schale haften.
      4. Aspirieren Sie das EDTA, lösen Sie die Kolonien, indem Sie 10 ml 1x PBS stark auf die Oberfläche der Schale pipettieren und sammeln Sie das gesamte Medium und die Zellen in einem 50-ml-Röhrchen.
      5. Fügen Sie 20 mL 1x PBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 4 Minuten, um das restliche EDTA auszuwaschen.
      6. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 3 ml Gefriermedium resuspendieren.
      7. Verteilen Sie die hPS-Zellen gleichmäßig auf die drei Kryoröhrchen à 1 ml.
      8. Über Nacht bei -80 °C in einer kontrollierten Gefrierbox oder einem Styroporsandwich lagern, um einen langsamen Temperaturabfall zu gewährleisten, und dann zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank umfüllen.

>2. Säen von hPSCs, um die Differenzierung zu starten (Tag 0)

HINWEIS: hPSCs sollten nach der Stabilisierung (d.h. nach dem Auftauen 2–3x gespalten) für die Differenzierung bereit sein. Achten Sie darauf, dass die Bienenvölker gesund sind, mit glatten, glänzenden Rändern und minimaler Differenzierung (Abbildung 2B).

1. Bereiten Sie bei Bedarf mit Basalmembranmatrix beschichtete Gerichte (24-Well- oder 6-Well-Gerichte) einen Tag vor Tag 0 zu. Bringen Sie die Gerichte zu Beginn der Differenzierung auf RT.
2. Stellen Sie die Tagesdifferenzierung nach Bedarf auf 0-1 Mittel.
3. Saugen Sie das E8 aus dem Konfluenten an, bereit, hPCSs zu spalten, und spülen Sie das Geschirr 2x mit 1x PBS ab.
4. 7 mL 0,25 M EDTA pro 100-mm-Schale zugeben, bei 37 °C, 5 % CO₂, 15 Min. inkubieren< μ> Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt wird die EDTA-Behandlung verlängert, um sich in einzelne Zellen zu verteilen.
5. Pipettieren Sie alle hPS-Zellen ab (sie sollten schwimmen) und geben Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie die gleiche Menge oder mehr von 1x PBS als EDTA-Lösung hinzu, um das EDTA zu verdünnen.
6. Bei 200 x g 4 min zentrifugieren.
7. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml Differenzierungsmedium vom Tag 0–1 hinzu und pipetieren Sie, um die Zellen zu homogenisieren. Fügen Sie anschließend mehr Medium hinzu und mischen Sie dann, um die Zelllösung auf eine Konzentration zu verdünnen, die ideal ist, um die Zellen zu zählen.
   Anmerkung: Verdünnen Sie die Zelllösung nicht zu stark. Zellen aus einer vollen 100-mm-Schale sollten zu Beginn in 5 ml Medium verdünnt werden.
8. Zählen Sie die Zellzahl mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer.
9. Verdünnen Sie die Zelllösung nach Bedarf, um 125.000 Zellen/^cm2 in einem niedrigen Endvolumen zu erreichen (z. B. 2 mL pro Vertiefung für eine 6-Well-Schale oder 500 μl pro Vertiefung für eine 24-Vertiefungsschale).
   Anmerkung: Ein geringes Volumen hilft den Zellen, sich schneller anzuheften.
10. Aspirieren Sie die gesamte Basalmembranmatrixlösung aus den beschichteten Schalen und geben Sie die Zelllösung in die Vertiefungen.
11. Inkubieren bei 37 °C in 5 % CO₂.

>3. Induktion von Neuralleistenzellen (Tag 1 bis Tag 10, Abbildung 1A)

1. Füttern Sie die Zellen an Tag 1 mit Differenzierungsmedium für Tag 0–1 (3 ml pro Vertiefung für 6-Well-Schalen und 1 ml pro Vertiefung für 24-Well-Gerichte).
2. Füttern Sie die Zellen an Tag 2 bis Tag 10 mit Differenzierungsmedium (3 ml pro Vertiefung für 6-Well-Gerichte und 1 ml pro Vertiefung für 24-Well-Gerichte).
3. Von nun an sollten die Zellen bis zum Tag 10 jeden zweiten Tag gefüttert werden (d.h. der nächste Fütterungstag ist Tag 4).
   Anmerkung: Ab dem 6. Tag sollten NC-Grate erkannt werden (Abbildung 1B). Um zu überprüfen, ob eine Differenzierung stattfindet, wird empfohlen, eine parallele Differenzierungskultur in kleineren Vertiefungen (d. h. 24 Vertiefungen) zu tragen, die für SOX10/AP2a gefärbt und für die Markergenexpression während des Zeitpunkts der Differenzierung verwendet werden können (Abbildung 1B, C).
4. Wenn Sie Zellen sortieren, fahren Sie mit Abschnitt 4 fort. Andernfalls fahren Sie mit Abschnitt 5 fort.

>4. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) für den Neuralleistenmarker CD49D und die Aggregation von NC-Zellen in Sphäroiden

HINWEIS: Für die FACS-Sortierung sollten die Proben auf Eis aufbewahrt werden und nach dem Färben bis zur Sortierung keinem Licht ausgesetzt werden.

1. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, wenn die Zellen sortiert sind.
2. Bereiten Sie Sphäroid Medium für Tag 10–14 vor.
3. Entfernen Sie am 10. Tag das Medium und waschen Sie es 1x mit 1x PBS.
4. Dissoziationslösung (siehe Materialtabelle) mit 2 mL pro Vertiefung für eine 6-Well-Schale oder 1 mL pro Vertiefung für eine 24-Well-Schale zugeben und 20 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
5. Pipettieren Sie alle hPS-Zellen ab und geben Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen.
6. Füllen Sie den Rest des Röhrchens mit FACS-Puffer und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 4 min.
   Anmerkung: Jedes 50-ml-Röhrchen kann bis zu 20 ml oder weniger Zelllösung aufnehmen. Das Volumen des FACS-Puffers sollte hoch genug sein, um die Dissoziationslösung zu neutralisieren.
7. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen mit der entsprechenden Menge FACS-Puffer (~2 mL pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) und zählen Sie, um die Zellzahl zu bestimmen.
8. Bereiten Sie die folgenden Beispiele vor.
   1. Probe 1 (ungefärbte Kontrolle): 1 x 10⁶ Zellen in 400 μl FACS-Puffer. Filtern Sie die Zellen durch eine 20 μm Siebkappe und halten Sie das Röhrchen auf Eis.
   2. Probe 2 (nur DAPI-Kontrolle): 1 x 10⁶ Zellen in 400 μl FACS-Puffer mit 0,5 μg/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Filtern Sie die Zellen durch ein FACS-Rohr mit Siebkappe und halten Sie das Rohr auf Eis.
   3. Probe 3 (CD49D-markiert): Den Rest der Zellen mit FACS-Puffer suspendieren, der Phycoerythrin/Cyanin7 (PE/Cy7)-konjugierten CD49D-Antikörper (5 μl für 1 x 106 Zellen pro 100 μl FACS-Puffer) in einem 15-ml-Röhrchen suspendiert und 20 Minuten lang auf Eis inkubiert.
9. Füllen Sie die Röhrchen mit FACS-Puffer und zentrifugieren Sie sie bei 200 x g für 4 min.
10. Den Überstand verwerfen und alle 5–10 x^{10 6} Zellen in 1 ml FACS-Puffer mit 0,5 μg/ml DAPI gemäß den Anweisungen des Herstellers resuspendieren.
11. Filtern Sie die Zellen durch das FACS-Rohr mit dem Siebdeckel und halten Sie das Rohr auf Eis.
12. Bereiten Sie FACS-Entnahmeröhrchen mit 2 ml FACS-Puffer vor.
13. Sortieren Sie das FACS-Gerät mit Lasern, die DAPI und PE-Cy7 erkennen können, um die CD49D⁺-Population zu isolieren.
14. Zählen Sie nach dem Sortieren die sortierten Zellen.
15. Alle sortierten Zellen werden zentrifugiert und in Sphäroidmedium an Tag 10–14 auf eine Endkonzentration von 0,5 x 10⁶ Zellen pro 500 μl Medium resuspendiert.
16. Platte 0,5 x 10⁶ Zellen pro Well in 24-Well-Platten mit extrem geringer Anhaftung.
17. Die Zellen werden bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert.

>5. Aggregation von NC-Zellen in Sphäroiden

1. Wenn die NC-Zellen nicht mit FACS isoliert werden, sondern direkt zu Sphäroiden aggregiert werden, bereiten Sie die Zellen zunächst wie in den Schritten 4.2–4.5 beschrieben vor.
2. Füllen Sie den Rest des Röhrchens mit 1x PBS und zentrifugieren Sie es bei 200 x g für 4 min.
3. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen mit einer angemessenen Menge Sphäroidmedium für Tag 10–14 (z. B. ~2 ml Medium pro Vertiefung für eine 6-Well-Platte) und zählen Sie, um die Zellzahl zu bestimmen.
4. Verdünnen Sie die Zellen in Sphäroidmedium Tag 10–14 auf 0,5 x 10⁶ Zellen pro 500 μl Medium.
5. Platte 500 μl der Zellsuspension pro Well in 24-Well-Platten mit extrem geringer Anhaftung.
6. Die Zellen werden bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert.

>6. NC-Sphäroiderhaltung und sympathische Vorläuferinduktion (Tag 10 bis Tag 14, Abbildung 3A)

1. Option 1: Minimale Sphäroidkultur
   1. Geben Sie an Tag 11 500 μl Sphäroidmedium für Tag 10–14 zu den NC-Sphäroiden, ohne das vorhandene Medium von Tag 10 zu aspirieren. Inkubieren bei 37 °C in 5 % CO₂.
   2. Kippen Sie an Tag 12 die Platte, um die NC-Sphäroide auf einer Seite der Vertiefungen zu akkumulieren. Saugen Sie vorsichtig so viel Medium wie möglich ab und füttern Sie es mit 1 ml Sphäroidmedium für Tag 10–14.
   3. Füttern Sie die Zellen jeden Tag bis zum 14. Tag.
   4. Optional: Wenn sich die Sphäroide aggregieren und einen großen Klumpen erzeugen, verwenden Sie eine Pipette, um die Sphäroidklumpen aufzubrechen. Dadurch wird auch sichergestellt, dass einzelne Sphäroide nicht zu groß werden.
      Anmerkung: Der ideale Sphäroidgrößenbereich sollte bei etwa 100–500 μm liegen. Innerhalb dieses Bereichs ist die Größe der einzelnen Sphäroide nicht entscheidend. Wichtig für den weiteren Erfolg ist jedoch die Morphologie, wie z.B. glatte und klare Kanten (Abbildung 2 und Abbildung 4). Am Tag 14 enthält jede 24-Well-Platte idealerweise etwa 50–60 Sphäroide unterschiedlicher Größe innerhalb des oben genannten Größenbereichs.
2. Option 2: Erweiterte Sphäroidkultur
   1. Füttern Sie am Tag 15 zur Aufbewahrung von NC-Sphäroiden mit 1,5 ml Sphäroidmedium am Tag 10–14 mit 0,5 μM RA. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO₂,
      Anmerkung: RA sollte bei jeder Fütterung frisch zugegeben und immer bei -80 °C gelagert werden.
   2. Von nun an bis zum 28. Tag jeden zweiten Tag füttern und dann mit dem Plattieren der Sphäroide fortfahren (Abschnitt 7.1).
      Anmerkung: Die wachsenden Sphäroide werden ca. 1x pro Woche gespalten, indem sie mit einer 1-ml-Pipette pipettiert werden, um sie aufzubrechen. Sie werden in einem ungefähren Verhältnis von 1:2 bis 1:4 gespalten. Innerhalb der 2-wöchigen Expansionsphase sollte sich die Anzahl der Zellen ungefähr vervierfachen.

>7. Differenzierung und Reifung des sympathischen Neurons (SymN) (Option 1: nach Tag 14; Option 2: nach Tag 28)

1. Anrichten von Sphäroiden in normalen Gerichten
   1. Bereiten Sie PO/LM/FM-beschichtete 24-Well-Platten vor.
   2. Bereiten Sie das symN-Medium mit 0,125 μM RA (bei jeder Fütterung frisch zugeben) und 10 μM Y27632 (nur Tag 14) zu.
   3. Kippen Sie an Tag 14 die Platte, um NC-Sphäroide auf einer Seite der Vertiefungen anzusammeln. Saugen Sie vorsichtig so viel Medium wie möglich ab und füttern Sie es mit 1 ml symN-Medium.
   4. Entfernen Sie LM/FN von den beschichteten Platten.
   5. Teilen Sie jede Vertiefung von der 24-Well-Platte auf und plattieren Sie sie in 4 separate Vertiefungen der neuen, beschichteten 24-Well-Platte. Jede ursprüngliche Vertiefung hat 1 ml und enthält ~50–60 Sphäroide. Dies ergibt 250 μl, die etwa 10–15 Sphäroide für jede Vertiefung auf der neuen Platte enthalten.
   6. Fügen Sie 250 μl zusätzliches Medium pro Vertiefung hinzu.
      Anmerkung: Dies ist eine Aufteilung von 1:4; Achten Sie darauf, dass die Sphäroide richtig in der Lösung verteilt sind, so dass die Spaltung relativ gleichmäßig ist. Die Anzahl der Sphäroide wird nicht gezählt, da die endgültige Anzahl keinen Einfluss auf den Erfolg der Erzeugung von SymNs hat.
   7. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO₂.
   8. An Tag 15 (oder Tag 29 für Option 2) füttern Sie, indem Sie das gesamte Medium durch 1 ml symN-Medium mit 0,125 μM RA ersetzen. Von nun an sollten die Neuronen bis zum 20. Tag (bzw. bis zum 35. Tag bei Option 2) alle 2 Tage gefüttert werden.
   9. Nach Tag 20 (oder Tag 35 für Option 2) sollten die Neuronen gefüttert werden, indem nur die Hälfte des vorhandenen Mediums (500 μl) vorsichtig ausgetauscht wird. Füttern Sie von nun an jede Woche, es sei denn, das Medium färbt sich schnell gelb.
   10. Füttern Sie wöchentlich bis zum gewünschten Zeitpunkt.
       HINWEIS: SymNs neigen dazu, sich in ganglienartigen Strukturen zu aggregieren und neigen dazu, sich von den Kulturschalen zu lösen. Um dies zu verhindern, empfiehlt sich eine halbe Fütterung und minimale Handhabung.

Ergebnisse

Abbildung 1: NC-Induktion. (A) Zeitplan und Behandlungen für die NC-Induktion von Tag 0 bis Tag 10. (B) Die Morphologie und Bildung der NC-Kämme wurden alle 2 Tage durch Hellfeldmikroskopie überwacht. Die Zellen wurden zu jedem Zeitpunkt nach Tag 2 für AP2A (rot) und SOX10 (grün) co-gefärbt. Alle Immunfluoreszenzbilder wurden mit DAPI gegengefärbt. Rote Pfeile zei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 mm Zellkulturschalen	Falke	353003
15 mL konische Gewebekulturröhrchen	VWR/Corning	Tel.: 89039-664
24-Well-Gewebekulturplatten	Falke	353047
24-Well-Platten mit extrem niedrigem Aufsatz	Corning	07 200 601 und 07 200 602
5 % CO2/20 % O2 -Gewebekultur-Inkubator	Thermo Fisher/Life Technologies	Heracell VIOS 160i
50 ml konische Gewebekulturröhrchen	VWR/Corning	Artikel-Nr.: 89039-656
6-Well-Gewebekulturplatten	Costar	3516
Accutase	Innovation Zelltechnologien	AT104500	Lösung zur Zelldissoziation
Anti-AP2a-Antikörper	Abcam (Englisch	Artikel-Nr.: ab108311	Wirt: Kaninchen; 1:400 Verdünnung
Anti-Ascl1-Antikörper	BD Pharmingen	556604	Wirt: Maus IgG1; Verdünnung 1:200
Anti-CD49D-Antikörper	BioLegende	304313	Wirt: Maus IgG1; 5 μl/Million Zellen in 100 μl Volumen
Anti-CD49D-Antikörper (Isotyp)	BioLegende	400125	Wirt: Maus IgG1; 5 μl/Million Zellen in 100 μl Volumen
Anti-DAPI-Antikörper	Sigma	Nr. D9542	1:1000 Verdünnung
Anti-DBH-Antikörper	Immunstern	Artikel-Nr.: 22806	Wirt: Kaninchen; 1:500 Verdünnung
Anti-GFP-Antikörper	Abcam (Englisch	AB13970	Wirt: Huhn; 1:1000 Verdünnung
Anti-HOXC9-Antikörper	Santa Cruz Biotechnologie	SC-365692	Wirt: Maus IgG1; Verdünnung 1:100
Anti-NET1-Antikörper	Mab	NET17-1	Wirt: Maus; Verdünnung 1:1000
Anti-PRPH-Antikörper	Santa Cruz Biotechnologie	Artikel-Nr.: SC-377093/H0112	Wirt: Maus IgG2a; Verdünnung 1:200
Anti-SOX10-Antikörper	Abcam (Englisch	AB50839	Wirt: Maus; Verdünnung 1:100
Anti-TH-Antikörper	Pel-Frostz	Nr. P40101 bis 150	Wirt: Kaninchen; 1:500 Verdünnung
Ascorbinsäure	Sigma	A8960-5G	Bestandskonzentration: 100 mM
B27 Beilage	Thermo Fisher/Life Technologies	Artikel-Nr.: 12587-010	Bestandskonzentration: 50x
BDNF	F&E-Systeme	248-BD	Stammkonzentration: 10 μg/mL
BMP4	F&E-Systeme	314-BP	Bestandskonzentration: 6 mM
Zähler für Zellen	Thermo Fisher/Life Technologies	Gräfin II.
Objektträger für Zellzählkammern	Invitrogen	Nr. C10312
Zentrifuge	Eppendorf	57021 und 5424R
CHIR99021	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 4423	Bestandskonzentration: 6 mM
Kryo-Fläschchen	Thermo Fisher/Life Technologies	375353
dbcAMP	Sigma	Nr. D0627	Bestandskonzentration: 100 mM
DMEM	Thermo Fisher/Life Technologies	Tel.: 10829-018	Bestandskonzentration: 1x
DMEM/F12	Thermo Fisher/Life Technologies	Tel.: 11330-057	Bestandskonzentration: 1x
Dmso	Thermo Fisher/Life Technologies	Nr. BP231-100
E6 mittel	Gibco	Nr. A15165-01
E8 mittel	Gibco	Nr. A15169-01	Bestandskonzentration: 1x
E8-Ergänzung	Gibco	Nr. A15171-01	Bestandskonzentration: 50x
Edta	Sigma	ED2SS	Bestandskonzentration: 0,5 M
FACS-Maschine	Beckman Coulter	CytoFLEX (für FACS)
FACS-Maschine	Beckman Coulter	MoFlo Astrios EQ (zum Sortieren)
FACS-Röhren (blaue Filterkappe)	Falke	352235
FACS-Röhrchen (weiße Kappe)	Falke	352063
Fötales Rinderserum (FBS)	Atlanta Biologicals	Nr. S11150
GDNF	PeproTech	450	Stammkonzentration: 10 μg/mL
Geltrex	Invitrogen	A1413202	Basalmembran-Matrix; Bestandskonzentration: 100x
hPS-Zellen	Thomson et al., (1998)	WA09
hPS-Zellen	Oh et al. (2016)	H9-PHOX2B::eGFP
Humanes Fibronektin (FN)	VWR/Corning	Tel.: 47743-654	Stammkonzentration: 1 mg/mL
L-Glutamin	Thermo Fisher/Gibco	Artikel-Nr.: 25030-081	Bestandskonzentration: 200 mM
LN-Behälter	Kundenspezifische biogene Systeme	V-1500AB
Maus-Laminin I (LM)	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 3400-010-01	Stammkonzentration: 1 mg/mL
N2-Ergänzung	Thermo Fisher/Life Technologies	Artikel-Nr.: 17502-048	Bestandskonzentration: 100x
Neurobasales Medium	Gibco	Artikel-Nr.: 21103-049	Bestandskonzentration: 1x
NGF	PeproTech	Nr. 450-01	Stammkonzentration: 25 μg/mL
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	Nr. 14190-136	Bestandskonzentration: 1x
Poly-L-Ornithinhydrobromid (PO)	Sigma	Nr. P3655	Bestandskonzentration: 15 mg/mL
Primocin (Antibiotika)	InvivoGen	ANTPM1	Bestandskonzentration: 50 mg/mL
qPCR-Maschine	Bio-Rad Laboratorien	C1000 Berührung
qPCR-Platten	Bio-Rad Laboratorien	HSP9601
rekombinante FGF2	F&E-Systeme	233-FB/CF	Stammkonzentration: 10 μg/mL
Retinsäure	Sigma	Nr. R2625	Bestandskonzentration: 1 mM
SB431542	Tocris/F&E-Systeme	Nr. 1614	Konzentration des Stoffes: 10 mM
Trypan-Blau	Corning	MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)	Thermo Fisher/Life Technologies	Nr. A14700	Stammkonzentration: 0,5 mg/ml
Wasserbad	VWR/Corning	706308
Nr. Y27632	F&E-Systeme	Nr. 1254	Konzentration des Stoffes: 10 mM