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>1. Vorbereitungen
- Bereiten Sie 10 ml Dissektionsmedium vor und geben Sie 200 μl 100x Penicillin-Streptomycin in 9,8 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12).
- Bereiten Sie L-Cystein-Lösung vor: auf 10 ml Wasser für die Gewebekultur und fügen Sie 120 mg L-Cystein hinzu. Lagern Sie die L-Cystein-Lösung bis zu 2 Wochen bei 4 °C oder in Aliquoten bei -20 °C bis zu 1 Jahr.
- Bereiten Sie die DNase I-Lösung vor: Geben Sie 10 mg DNase I in 1 ml Wasser für die Gewebekultur. Lagern Sie die DNase I-Lösung bis zu 2 Monate lang bei 4 °C.
- Zubereitung der Papainlösung: Zur Herstellung der Papainlösung werden 100 μl Papain (ca. 140 Einheiten), 100 μl DNase I (1%) und 200 μl L-Cystein (12 mg/ml) in 5 ml DMEM/F12 gegeben. Bereiten Sie die Papainlösung jedes Mal frisch vor und sterilisieren Sie sie vor Gebrauch mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
- Waschlösung vorbereiten: Zur Herstellung von 100 ml Waschlösung 650 μl Glucose 45%, 500 μl 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure, HEPES 1 M und 5 ml fötales Rinderserum (FBS) in 93,85 ml Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) 1x geben. Die Waschlösung vor Gebrauch mit einem 0,22 μm Porenfilter sterilisieren. Lagern Sie die Waschlösung bis zu 2 Monate bei 4 °C.
- Insulinlösung herstellen: Zur Herstellung von 2 ml Insulinlösung einen 25-μl-Tropfen 10 N Natriumhydroxid (NaOH) und 100 mg Insulin in 2 ml Wasser für die Gewebekultur geben.
- Bereiten Sie Lösungen für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) vor: Löse beide Mitogene in DMEM/F12 in einer Konzentration von 100 μg/ml auf. Als 10 μl Aliquots bei -20 °C lagern.
- B-27- und N-2-Medien vorbereiten: B-27- und N-2-Supplemente bei -20 °C als 500 μl bzw. 1 ml Aliquote lagern.
- Z-Differenzierungsbedingungsmedium vorbereiten: Zur Herstellung von 100 ml Z-Differenzierungsbedingungsmedium 40 μl Insulin (50 mg/ml), 500 μl B-27, 1 ml N-2, 650 μl Glucose 45 % und 1 ml 100 x Penicillin-Streptomycin in 97,81 ml DMEM/F12 geben. Sterilisieren Sie das Medium für die Z-Differenzierungsbedingung vor der Verwendung mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm. Lagern Sie das Z-Differenzierungsbedingungsmedium bis zu 1 Woche bei 4 °C.
- Z-Bedingungsmedium vorbereiten: Zur Herstellung von 50 ml Z-Bedingungsmedium 10 μl EGF und 10 μl FGF in 50 ml steriles Z-Differenzierungsmedium (20 ng/ml) geben. Lagern Sie das Z-Condition-Medium bis zu 1 Woche bei 4 °C.
- Beschichtungslösung für die Differenzierungskultur vorbereiten: Für 5 ml extrazelluläre Beschichtungslösung 100 μl der extrazellulären Matrixlösung (z. B. Matrigel) in 4,9 ml DMEM/F12 geben. Extrazelluläre Matrixlösung bei 4 °C auf Eis auftauen. Nach dem Auftauen bis zu 2 Wochen bei 4 °C aufbewahren.
>2. Dissektion des Gehirns eines erwachsenen Zebrafisches
- Bereiten Sie ein Präparierbett vor, indem Sie eine 100 mm x 15 mm große Petrischale mit Gel-Eisbeuteln füllen. Dann den Deckel auf die Petrischale legen und bei -20 °C inkubieren, bis das Gel gefriert. Legen Sie ein Quadrat sauberes Filterpapier auf den Deckel und wickeln Sie sowohl das Filterpapier als auch die Petrischale mit Plastikfolie ein.
- Reinigen und sterilisieren Sie alle Mikrodissektionsinstrumente vor jedem Gebrauch mit 70 % Ethanol oder Hitze. Platzieren Sie alle sterilisierten Präparierinstrumente in der Nähe des Präpariermikroskops und stellen Sie das Präparierbett unmittelbar vor der Euthanasie unter das Mikroskop mit Lichtwellenleiterbeleuchtung.
- Sammle 2 erwachsene Zebrafische für eine Neurosphärenvorbereitung des gesamten Gehirns und 3 bis 4 Zebrafische, um Neurosphären aus präparierten Hirnregionen zu erzeugen.
- Euthanasieren Sie erwachsene Zebrafische (8-12 Monate alt) nach einem Protokoll, das vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurde. Tauchen Sie den Fisch anschließend 5-10 Sekunden lang in 75%iges Ethanol und legen Sie ihn schnell in das Sezierbett, gefolgt von der Enthauptung auf Höhe der Kiemen mit einer chirurgischen Klinge.
- Um Tiere einzuschläfern, verabreichen Sie eine Überdosis (300 mg/l) Tricain-Methansulfonat, bis sich der Herzschlag des Tieres allmählich verlangsamt und die Durchblutung stoppt, und tauchen Sie es dann in Eiswasser.
- Drehen Sie den Kopf mit der Rückenseite nach unten und machen Sie mit der Schere einen Längsschnitt von der Schnittseite zum Mund. Mit der Pinzette legen Sie die Schädelbasis frei und entfernen das gesamte angrenzende Gewebe. Schneiden Sie die Seitenwände des Schädels vom Anfang des Rückenmarks in Richtung Tectum ab.
- Schneiden und entfernen Sie mit der Schere die Sehnerven und entfernen Sie dann beide Seiten des seitlichsten Teils des Schädels auf Höhe des Tectums. Drehen Sie den Kopf mit der Bauchseite nach oben. Ziehe mit einer Pinzette den Rest des apikalsten Teils des Schädels ab.
- Das Gehirn wird zusammen mit dem restlichen Teil des Schädels in eine neue Schale mit dem Seziermedium (1.1) überführt. Reinigen Sie das Hirngewebe im Präpariermedium mit dem Kunststoffgriff des Mikromessers, wobei alle Gehirnstrukturen intakt bleiben.
- Setzen Sie von diesem Punkt aus das Protokoll mit dem gesamten Zebrafischgehirn fort.
- Alternativ kann dieses Protokoll an bestimmte Hirnregionen angepasst werden, um Neurosphären aus dem gesamten Zebrafischgehirn oder aus dem Telencephalon, dem Tectum/Diencephalon oder dem Kleinhirn zu erzeugen, die mit einem frischen Skalpell präpariert werden. Verwenden Sie eine neuronalspezifische fluoreszierende transgene Linie für Zebrafische, um die interessierende Gehirnregion gemäß Abbildung 1 zu präparieren.
>3. Einzelzelldissoziation des erwachsenen Gehirns
- Führen Sie alle nachfolgenden Arbeiten in einer biologischen Sicherheitswerkbank durch. Das Hirngewebe wird in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 800 μl Dissektionsmedium (hergestellt in Schritt 1.1) überführt. Entfernen Sie das Präpariermedium durch Pipettieren, ohne das Hirngewebe zu berühren.
- 500 μl Papainlösung (Schritt 1.4) zugeben und das Hirngewebe bei 37 °C 10 min lang verdauen. Inkubieren Sie nicht länger als 15 Minuten, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen verringern könnte.
- Übertragen Sie nach der Inkubation das Hirngewebe mit 500 μl der Papainlösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze, die ~0,25 Zoll vom Boden entfernt geschnitten wird. Dissoziieren Sie das Hirngewebe sanft, indem Sie mit derselben Spitze 10 Mal langsam auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie nicht mehr als 15 Mal auf und ab und erzeugen Sie während dieses Schritts keine Luftblasen, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen könnte.
- Inkubieren Sie das Hirngewebe erneut bei 37 °C für 10 Minuten, gefolgt von 10-13 maligem Auf- und Abpipettieren mit einer ungeschnittenen 1.000 μl normalen Spitze. Pipettieren Sie nicht mehr als 15 Mal auf und ab, um den Zelltod zu vermeiden.
- Stoppen Sie den enzymatischen Aufschluss, indem Sie 2 ml Waschlösung (Schritt 1.5) hinzufügen und die Zellsuspension bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in der restlichen Lösung, indem Sie mit einem Finger kräftig auf das Röhrchen klopfen und dann mit einer normalen 1.000-μl-Spitze auf und ab pipettieren. Fügen Sie anschließend 2 ml Waschlösung hinzu.
- Überprüfen Sie zu diesem Zeitpunkt unter dem Mikroskop, ob eine Einzelzellsuspension erhalten wurde. Die Zellsuspension wird erneut bei 800 x g für 5 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet mit 1 ml frischem Z-Medium wieder suspendiert (Schritt 1.10).
- Färbe die Zellen mit Trypanblau und zähle die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer, indem du blaue tote Zellen ausschließt. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 200 μl Zellsuspension und 300 μl frischem Z-Condition-Medium in jeder Vertiefung vor. Keimzellen mit einer Dichte von ~500 Zellen/μl. Kultivierte Zellen in einem Inkubator bei 30 °C mit 5 % CO2 aufbewahren, da aus dem Gehirn von Zebrafischen stammende Neurosphären bei 37 °C nicht gut wachsen.
>4. Erzeugung von primären Neurosphären
- Beobachten Sie nach 1 Tag in vitro (DiV1) die Einzelzellsuspension aus dem adulten gesamten Gehirn unter dem Mikroskop und notieren Sie, ob sich in der Mitte der Vertiefung Ablagerungen angesammelt haben. Entfernen Sie vorsichtig alle Ablagerungen, indem Sie ca. 100 μl Medium pipettieren (wenn möglich weniger). Fügen Sie anschließend 100 μl frisches Z-Bedingungsmedium hinzu. Zu diesem Zeitpunkt sollten einzellige Suspensionen beobachtet werden (Abbildung 2A DiV1).
- Nach 2 Tagen in vitro (DiV2) expandieren Sie die kultivierten Zellen. Sammeln Sie mit einer 1.000-μl-Pipette mit abgeschnittener Spitze 250 μl Zellsuspension aus jeder Vertiefung und überführen Sie sie in eine neue Vertiefung. Geben Sie 250 μl frisches Z-Medium in alle Vertiefungen. Bevor Sie die kultivierten Zellen expandieren, homogenisieren Sie die Suspension sehr vorsichtig, indem Sie sie durch die Vertiefung auf und ab pipettieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2 für die folgenden 4 Tage in vitro (DiV4). Eine fortschreitende Vergrößerung der Neurosphären sollte in der Mitte und an den Rändern der Vertiefung bei DiV3 und DiV4 sichtbar sein (Abbildung 2B und C).
Anmerkung: Primäre Neurosphären können für die Passage oder Differenzierung zur Beurteilung der Multipotenz verarbeitet werden. Alternativ können sie für die Nukleofektion oder Lipo-Transfektion verarbeitet werden, um die Rolle bestimmter Gene während des Differenzierungsprozesses zu charakterisieren.
>5. Passage der primären Neurosphären
- Entnehmen Sie 250 μl Gewebekultur aus jeder Vertiefung und dissoziieren Sie die DiV4-Neurosphären mechanisch mit einer 1-ml-Pipette. Pipettieren Sie nicht zu schnell auf und ab, da die Bildung von Luftblasen den Zelltod erhöhen kann.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und verteilen Sie 800 Zellen/μl in 250 μl Primärkulturüberstand in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.
- Geben Sie 250 μl Z-bedingtes Medium in jede Vertiefung.
- Nach 2 Tagen in vitro (DiV2) expandieren Sie die kultivierten Zellen wie in Schritt 4.2 und 4.3 beschrieben.
>6. Differenzierung der primären Neurosphären
- Sterilisieren Sie die Deckgläser durch Eintauchen in 70%iges Ethanol für 10 Minuten und trocknen Sie die Deckgläser dann bei RT, indem Sie sie in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte legen.
- 300 μl extrazelluläre Beschichtungslösung (Schritt 1.11) in der Mitte des Deckglases so zugeben, dass es sich weit ausdehnen und das gesamte Deckglas bedecken kann. Anschließend 1 h bei 37 °C inkubieren (mit dem befeuchteten Zellkultur-Inkubator).
- Entfernen Sie die extrazelluläre Beschichtungslösung nach der Inkubation und trocknen Sie das Deckglas 2 Stunden lang bei 37 °C.
- Entnehmen Sie 250 μl Gewebekultur aus jeder Vertiefung. Dissoziieren Sie alle primären DiV4-Neurosphären pro Vertiefung mechanisch mit einer 1-ml-Pipette (mit breiterer Spitze), indem Sie auf und ab pipettieren.
- Dissoziierte Neurosphärenzellsuspensionen mit einer Zelldichte von 4 x 103 Zellen/ml auf zuvor hergestellte, mit extrazellulärer Matrix beschichtete Deckgläser (Schritt 6.1-6.3) aussäen und mindestens 30 min bei 30 °C in 5 % CO 2 aufbewahren, bis sie an das Substrat anhaften. Entfernen Sie dann das Kulturmedium und fügen Sie rasch 1 ml vorgewärmtes frisches Z-Differenzierungsmedium hinzu (Schritt 1.9), bevor Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 30 °C in 5 % CO2 kultivieren.
- Ersetzen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Z-Differenzierungsbedingungsmediums während der Zeit der Zelldifferenzierung.
