Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Erzeugung von Gehirn-Organoiden (23 Tage)
- Beginn des Neuroektoderms (5 Tage)
HINWEIS: Folgende Punkte sollten vor Beginn der Differenzierung beachtet werden. Die Reprogrammierungsmethode (lentiviral-, Sendai-Virus-, episomale oder microRNA-basiert usw.) zur Gewinnung humaner iPS-Zellen sollte idealerweise für alle Patienten- und Kontroll-iPS-Zellen gleich sein. Es stehen verschiedene Reprogrammierungskits und Anweisungen auf der Grundlage veröffentlichter Protokolle zur Verfügung. Die Qualität der humanen iPSC-Linien ist der Schlüssel zu einer optimalen Differenzierung. Überwachen Sie die Kolonie- und Zellmorphologie mit einem Mikroskop und validieren Sie die Pluripotenz, indem Sie die Expression von Markern wie Oct3/4, Nanog oder TRA-1-60 testen.
- Kultivieren Sie humane iPSCs unter feederfreien Bedingungen in Medium A auf einer Schale, die mit Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Matrix beschichtet ist.
Anmerkung: Züchten Sie humane iPS-Zellen feeder- und serumfrei, um einen definierten Kulturzustand aufrechtzuerhalten und einen zusätzlichen Schritt zur Entnahme von embryonalen Feederzellen (MEFs) der Maus vor Beginn der Differenzierung zu vermeiden. Die optimale Passagenzahl für humane iPSCs, um mit der Differenzierung zu beginnen, reicht von Passage 15 bei der Reprogrammierung bis zu Passage 70 insgesamt. Während des Passierens lösen Sie die hiPSC-Kolonien, während sich die Zellen zusammenlagern, indem Sie eine geeignete Zellablösung, die mechanisch wenig belastet ist, und eine serologische 2-ml-Pipette verwenden, um die Aggregate in eine neue Schale zu übertragen. Vermeiden Sie die Dissoziation zu einzelnen Zellen, da dies in den meisten iPSC-Linien zu Differenzierung und Apoptose führen kann. Es wurde berichtet, dass die langfristige Einzelzellpassage genomische Veränderungen in humanen iPSCs verstärken kann. Vermeiden Sie Zellablösungsverfahren, die einen Zentrifugationsschritt erfordern, um die Ablösungslösung zu entfernen, da dies die Gesamtlebensfähigkeit von iPSCs verringert. Testen Sie alle Kulturen regelmäßig auf mikrobielle Kontaminationen, insbesondere Mykoplasmen, da dies die Qualität der iPSCs und ihre Differenzierungsfähigkeit beeinträchtigen kann.
- Beschichten Sie eine 60-mm-Gewebekulturschale mit einer EHS-Matrix gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Tauen Sie ein Aliquot von 1 x 106 humanen iPSCs auf. Die iPS-Zellen werden in einer 60-mm-Gewebekulturschale ausgesät, die mit EHS-Matrix beschichtet ist und 5 ml Medium A enthält (siehe Materialtabelle). Wechseln Sie das Medium täglich und durchlaufen Sie die Passage nach 5 bis 7 Tagen, wenn die Zellen eine Konfluenz von ~80% erreichen.
Anmerkung: Die aufgetauten iPSCs werden mindestens einmal vor Beginn der Differenzierung bei 80% Konfluenz unter Verwendung von Standardmethoden, wie z.B. der enzymfreien Ablösung von Kolonien, durchgelassen. Kurz gesagt, das iPS-Medium entfernen, die Zellen einmal mit vorgewärmtem 37 °C Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) waschen und die iPSCs gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Reagenz A inkubieren (siehe Materialtabelle). Überschreiten Sie nicht die empfohlene Inkubationszeit, um eine Dissoziation mit einzelnen Zellen zu vermeiden. Humane iPSCs sollten abgelöst werden und als Aggregate schwimmen, nicht als einzelne Zellen. Anschließend können sie in neue, mit EHS-Matrix beschichtete Schalen umgefüllt werden. So können z.B. iPSC-Aggregate aus einer 60-mm-Schüssel auf 4 neue 60-mm-Schüsseln verteilt werden.
b. Prüfen Sie mit einem Mykoplasmen-Nachweiskit gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Mykoplasmen. Verwenden Sie nur mykoplasmenfreie iPSCs, da Mykoplasmen die Differenzierungsfähigkeit von iPSCs verändern können.
- Dissoziieren Sie iPS-Zellen (80 % konfluent) und bereiten Sie eine Einzelzellsuspension mit Reagenz B vor
- Waschen Sie die iPSCs einmal mit vorgewärmtem (37 °C) DMEM/F12.
- Geben Sie vorgewärmtes Reagenz B (z. B. 1 mL in einer 60-mm-Schale) hinzu und inkubieren Sie die iPSCs 5 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2.
- Schnippen Sie 20 Mal mit einer Fingerspitze an der Seite und am Boden der Schale, um die iPS-Zellen zu lösen. Überprüfen Sie, ob sich die Zellen unter dem Mikroskop abgelöst haben.
- Pipettieren Sie die Zellsuspension 5 Mal mit einer 1-ml-Mikropipette in der Schale auf und ab.
- Fügen Sie 3 ml Medium A hinzu, um 1 ml Reagenz B zu verdünnen, und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Die iPS-Zellen (500 x g) 4 Minuten lang bei Raumtemperatur sanft herunterschleudern.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL Medium B und zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
Anmerkung: Achten Sie darauf, nur Medium B für die Resuspension zu verwenden. Vermeiden Sie die Verwendung von Medium A, da es eine zu hohe Konzentration an bFGF enthält, die die Differenzierung hemmen könnte.
- Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 4,5 x 105 Zellen pro ml in Medium B, ergänzt mit 10 μM rho-assoziiertem Proteinkinase-Inhibitor (Y-27632).
- 100 μl pro Vertiefung in eine nicht haftende 96-Well-Platte mit V-Boden geben.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig in der Suspension verteilt sind, indem Sie das Röhrchen jedes Mal schütteln, bevor Sie 100-μl-Portionen herausnehmen. Es ist wichtig, dass jede Vertiefung eine gleichwertige Zellzahl enthält, um Neurosphären zu erhalten, die in Größe und Form homogen sind (runde, definierte Oberflächen).
- Die Platte mit den Zellen bei 500 x g und Raumtemperatur für 3 min vorsichtig herunterschleudern und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Wechseln Sie das Medium täglich, indem Sie 50 μl entfernen und in den nächsten 5 Tagen 50 μl frisches Medium B in jede Vertiefung geben.
>2. Einbettung von Neurosphären in die EHS-Matrix (4 Tage)
- Bereiten Sie das Neurosphärenmedium vor, indem Sie Folgendes mischen: 1:1 Mischung aus DMEM/F12 und Medium C (v/v), 1:200 (v/v) Supplement 1, 1:100 (v/v) Supplement 2 ohne (w/o) Vitamin A, 1:100 L-Glutamin, 0,05 mM nicht-essentielle Aminosäuren (MEM), 100 U/mL Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 1,6 g/l Insulin und 0,05 mM β-Mercaptoethanol.
- Sammeln Sie die Neurosphären mit einer 200-μl-Mikropipette unter Verwendung einer ~2 mm Spitze, die zuvor mit einer sterilen Schere geschnitten wurde.
- Legen Sie die Neurosphären in einem Abstand von ca. 5 mm zueinander auf eine Paraffinfolie (3 x 3 cm2) in eine leere 100-mm-Schale und entfernen Sie vorsichtig so viel wie möglich vom restlichen Medium.
- Geben Sie einen Tropfen (7 μl) EHS-Matrix auf jede einzelne Neurosphäre.
- Inkubieren Sie die EHS-Matrixtropfen mit den Neurosphären für 15 min in einem Inkubator.
- Waschen Sie die Neurosphären vorsichtig vom Paraffinfilm, indem Sie sie mit Neurosphärenmedium spülen. Verwenden Sie zum Spülen eine 1-ml-Mikropipette und eine neue 100-mm-Petrischale mit 10 ml Neurosphärenmedium.
- Inkubieren Sie die Neurosphären für die nächsten 4 Tage und fügen Sie am Tag 2.
2 ml frisches Neurosphärenmedium hinzu
Anmerkung: Achten Sie darauf, dass die Einlegeböden im Inkubator flach sind, damit die in die EHS-Matrix eingebetteten Neurosphären nicht auf einer Seite der Schale verklumpen.
>3. Organoide in einer rotierenden Suspensionskultur (14 Tage)
- Bereiten Sie das Organoid-Medium des Gehirns vor, indem Sie Folgendes mischen: 1:1 Mischung aus DMEM/F12 und Medium C (v/v), 1:200 (v/v) Ergänzung 1, 1:100 (v/v) Ergänzung 2 ohne Vitamin A, 1:100 l Glutamin, 0,05 mM MEM, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 1,6 g/l Insulin, 0,5 μM Dorsomorphin, 5 μM SB431542, und 0,05 mM β-Mercaptoethanol.
- Geben Sie 100 ml Organoid-Medium des Gehirns durch die Seitenarme in jeden Spinnerkolben und legen Sie ihn zum Vorwärmen für mindestens 20 Minuten in einen Inkubator.
- Stellen Sie ein Rührprogramm bei 25 U/min ein, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Anmerkung: Bevor Sie die in die EHS-Matrix eingebetteten Neurosphären in Spinnerkolben übertragen, stellen Sie sicher, dass sie alle getrennt sind. Wenn zwei oder mehr durch die EHS-Matrix verbunden sind, trennen Sie sie, indem Sie die Verbindungsmatrix mit einem Skalpell durchschneiden.
- Übertragen Sie die in die EHS-Matrix eingebetteten Neurosphären vorsichtig mit einer serologischen 2-ml-Pipette in Spinnerkolben mit 100 ml Organoidmedium. Verwenden Sie die Seitenarme des Spinnerkolbens, um die Neurosphären in den Kolben zu übertragen.
- Stellen Sie die Spinnerkolben auf eine magnetische Rührplattform in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2; dies ist Tag 0 der Organoidkultur.
- Wechseln Sie das Medium einmal pro Woche (oder öfter, wenn es einen Farbwechsel gibt), indem Sie die Hälfte des Mediums entfernen und die gleiche Menge frisches Medium hinzufügen.
Anmerkung: Wenn Sie die Spinnerkolben aus dem Inkubator nehmen, warten Sie 3-5 Minuten, bis die Organoide auf den Boden des Kolbens sinken können. Entfernen Sie das Medium, indem Sie die Pipettenspitze aus Glas (an eine Pumpe angeschlossen) auf die Oberfläche der Flüssigkeit legen. Das Medium wird vorsichtig durch eine seitliche Öffnung/einen seitlichen Arm des Kolbens abgesaugt. Diese Manipulationen müssen unter der laminaren Haube durchgeführt werden.
