Elektrostimulationsinduzierte Differenzierung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen

Zusammenfassung

Quelle: Chang, H. et al., Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices.J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert die Verwendung eines extrazellulären Matrix-beschichteten Mikrofluidik-Chips zur Unterscheidung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen oder NPCs durch elektrische Stimulation. Nach der Aussaat und dem Anhaften an der beschichteten Region wachsen NPCs, und die Anwendung eines Gleichstroms löst ihre Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten aus.

Protokoll

>1. Design und Herstellung des mehrkanaligen, optisch transparenten, elektrotaktischen (MOE) Chips

1. Zeichnen Sie Muster für die einzelnen Schichten aus Polymethylmethacrylat (PMMA) und das doppelseitige Klebeband mit einer geeigneten Software (Abbildung 1A, Materialtabelle). Schneiden Sie sowohl die PMMA-Platten als auch das doppelseitige Klebeband mit einem CO₂ -Laser-Anreißgerät (Abbildung 1B).
   1. Schalten Sie den CO₂ -Laserritzer ein und schließen Sie ihn an einen PC an. Öffnen Sie die entworfene Musterdatei mit der Software.
   2. Legen Sie die PMMA-Platten (275 mm x 400 mm) oder das doppelseitige Klebeband (210 mm x 297 mm) auf die Plattform des Laserritzers (Abbildung 2A). Fokussieren Sie den Laser mit dem Autofokus-Werkzeug auf die Oberfläche der PMMA-Platten oder des doppelseitigen Klebebandes.
   3. Wählen Sie den Laser-Ritzer als Drucker aus und "drucken" Sie dann das Muster mit dem Laser-Ritzer, um die direkte Ablation auf dem PMMA-Blatt oder doppelseitigen Klebeband zu starten und individuelle Muster auf dem PMMA-Blatt oder -Band zu erhalten (Abbildung 2B).
2. Entfernen Sie die Schutzfolie von den PMMA-Platten und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffgas.
   Anmerkung: Das Zeichnen des PMMA-Musters und die direkte Bearbeitung der PMMA-Platte wurden gemäß einem früheren Bericht durchgeführt.
3. Um mehrere Schichten PMMA-Platten miteinander zu verkleben, stapeln Sie drei Stücke 1 mm PMMA-Platten (Schichten 1, 2 und 3) und kleben Sie sie unter einem Druck von 5 kg/cm² in einem thermischen Bonder für 30 min bei 110 °C zu einer Fluss-/Elektrostimulationskanal-Anordnung (Abbildung 2C).
   Anmerkung: Verschiedene Chargen von kommerziell hergestellten PMMA-Platten haben leicht unterschiedliche Glasübergangstemperaturen (Tg). Die optimale Klebetemperatur muss in Schritten von 5 °C nahe der Tg getestet werden.
4. 12 Stück Adapter werden mit schnellwirkendem Cyanacrylatkleber auf die einzelnen Öffnungen in Schicht 1 der MOE-Chipgruppe geklebt.
   Anmerkung: Die Adapter werden aus PMMA im Spritzgussverfahren hergestellt. Die flachen Flächen an der Unterseite dienen zum Anschluss an den MOE-Chip. Die Adapter mit 1/4W-28 Innengewinde sind für den Anschluss von weißen fingerfesten Steckern, Flachbodensteckern oder Luer-Adaptern vorgesehen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie schnell wirkenden Cyanacrylatkleber verwenden. Vermeiden Sie Spritzer in die Augen.
5. Desinfizieren Sie die 1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3), das doppelseitige Klebeband (Schicht 4) und das 3 mm optische PMMA (Schicht 5) 30 Minuten lang mit ultravioletter (UV) Bestrahlung, bevor Sie den Chip zusammenbauen (Abbildung 1A).
6. Kleben Sie die 1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3) mit dem doppelseitigen Klebeband (Schicht 4) auf das 3 mm PMMA in optischer Qualität (Schicht 5), um die PMMA-Montage (Schichten 1-5) abzuschließen (Abbildung 1A).
7. Bereiten Sie das saubere Deckglas für die Montage auf dem Chip vor.
   1. Füllen Sie eine zehnfache Verdünnung des Reinigungsmittels in ein Färbeglas (siehe Materialtabelle) und reinigen Sie das Deckglas mit diesem Reinigungsmittel mit einem Ultraschallreiniger für 15 Minuten.
   2. Spülen Sie das Fleckenglas gründlich unter fließendem Leitungswasser aus, um alle Spuren des Reinigungsmittels zu entfernen.
   3. Spülen Sie weiter mit destilliertem Wasser, um alle Spuren von Leitungswasser zu entfernen, und wiederholen Sie Schritt 1.7.2 zweimal.
   4. Trocknen Sie das gereinigte Deckglas, indem Sie es mit Stickstoffgas anblasen.
8. Desinfizieren Sie die PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5), das doppelseitige Klebeband (Schicht 6) und das Deckglas (Schicht 7) 30 Minuten lang mit UV-Bestrahlung in einer Biosicherheitswerkbank, bevor Sie den Chip zusammenbauen (Abbildung 1A).
9. Kleben Sie das gereinigte Deckglas (Schicht 7) mit dem doppelseitigen Klebeband (Schicht 6) auf die PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5) (Abbildung 1A).
10. Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht in einer Vakuumkammer; verwenden Sie die MOE-Chip-Baugruppe für nachfolgende Verfahren (Abbildung 3).

>2. Beschichtung von Poly-L-Lysin (PLL) auf dem Substrat in den Zellkulturregionen

1. Bereiten Sie das Polytetrafluorethylenröhrchen, den Flachstecker, den Konusanschluss, den Konus-Luer-Adapter, den weißen fingerfesten Stecker (auch Stopper genannt), den Luer-Adapter, die Luer-Lock-Spritze und den schwarzen Gummistopfen vor (Abbildung 4A, Materialtabelle). Sterilisieren Sie alle oben genannten Komponenten in einem Autoklaven bei 121 °C für 30 Minuten.
2. Verschließen Sie die Öffnungen der Agarbrückenadapter (Abbildung 1A) mit den weißen, fingerfesten Steckern. Verbinden Sie den Steckverbinder mit flachem Boden über die Adapter für den Medieneinlass und -auslass mit der MOE-Chipbaugruppe (Abbildung 4B). Verbinden Sie den Konus-Luer-Adapter mit den 3-Wege-Absperrhähnen.
3. Fügen Sie 2 mL 0,01%ige PLL-Lösung mit einer 3-ml-Spritze hinzu, die mit dem 3-Wege-Absperrhahn des Mediumeinlasses verbunden ist (Abbildung 4B-).
4. Schließen Sie eine leere 3-ml-Spritze an den 3-Wege-Absperrhahn des Mediumauslasses an (Abbildung 4B-).
5. Füllen Sie die Zellkulturregionen mit der PLL-Lösung. Pumpen Sie die Beschichtungslösung manuell langsam hin und her. Schließen Sie die beiden 3-Wege-Absperrhähne, um die Lösung in den Kulturbereichen zu verschließen.
6. Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht bei 37 °C in einem Inkubator, der mit 5 % CO₂ -Atmosphäre gefüllt ist.

>3. Vorbereitung des Salzbrückennetzes

1. Öffnen Sie nach Schritt 2.6 die beiden 3-Wege-Absperrhähne und spülen Sie die Blasen in den Kanälen weg, indem Sie die Beschichtungslösung mit den beiden Spritzen manuell im Kanal hin und her pumpen.
2. Ziehen Sie 3 mL des vollständigen Mediums (Stammzellerhaltungsmedium, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium/Ham's Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12), 2% B-27 Supplement, 20 ng/mL EGF und 20 ng/mL bFGF) in eine 3 mL Spritze, die mit dem 3-Wege-Absperrhahn des Mediumeinlasses verbunden ist (Abbildung 4B- und Abbildung 4B- ).
3. Fügen Sie 3 ml vollständiges Medium hinzu, um die Beschichtungslösung in den Zellkulturregionen zu ersetzen. Schließen Sie eine leere 5-ml-Spritze an den 3-Wege-Absperrhahn des Mediumauslasses an (Abbildung 4B-).
4. Bereiten Sie das Salt-Bridge-Netzwerk vor (Abbildung 5).
   1. Schneiden Sie den schwarzen Gummistopfen so ab, dass ein Spalt entsteht, und führen Sie die Silber (Ag)/Silberchlorid (AgCl)-Elektroden durch den schwarzen Gummistopfen in die Luer-Lock-Spritze ein (Abbildung 4A).
   2. Ersetzen Sie den weißen fingerfesten Stopfen durch den Luer-Adapter und injizieren Sie 3 % heiße Agarose, um den Luer-Adapter zu füllen.
      Anmerkung: Für die Zubereitung der heißen Agarose 3 g Agarosepulver in 100 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen und im Autoklaven bei 121 °C für 30 min sterilisieren.
   3. Verbinden Sie die Luer-Lock-Spritze mit dem Luer-Adapter. Injizieren Sie 3% heiße Agarose durch den schwarzen Gummistopfen, um die Luer-Lock-Spritze mit der Spritze mit der Nadel zu füllen. Lassen Sie die Agarose 10 bis 20 Minuten abkühlen und fest werden.
      Anmerkung: Um die Volumenkapazität der Agarose zu erhöhen, wird die Luer-Lock-Spritze auf den Luer-Adapter aufgesetzt (Abbildung 4 und Abbildung 5). Dann werden die großen Elektroden in die Luer-Lock-Spritze eingeführt. Die Elektrode ist in der Lage, eine stabile elektrische Stimulation für das Langzeitexperiment zu liefern.

>4. Vorbereitung von mNPCs

1. Die mNPCs werden im kompletten Medium in einem 25T-Zellkulturkolben bei 37 °C in einem mit 5 % CO₂ -Atmosphäre gefüllten Inkubator kultiviert. Subkulturieren Sie die Zellen alle 3-4 Tage und führen Sie alle Experimente mit Zellen durch, die 3-8 Passagen von der ursprünglichen Quelle durchlaufen haben.
2. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie die Neurosphären bei 100 × g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Neurosphären mit 1x Dulbecco's PBS (DPBS). Schleudern Sie die Neurosphären bei 100 × g für 5 min.
3. Aspirieren Sie das 1x DPBS und resuspendieren Sie dann die Neurosphären im vollständigen Medium. Gründlich und vorsichtig mischen.
4. Fügen Sie 1 ml der Neurosphärensuspension mit einer 1-ml-Spritze hinzu, die mit dem 3-Wege-Absperrhahn des Auslasses verbunden ist (Abbildung 4B-).

>5. Aufbau des mikrofluidischen Systems für die DC-Pulsstimulation (Abbildung 6)

1. Installieren Sie den zellbestückten MOE-Chip auf der transparenten Indium-Zinnoxid (ITO)-Heizung, die auf einem programmierbaren X-Y-Z-Motortisch befestigt ist.
   Anmerkung: Die ITO-Oberflächentemperatur wird durch einen Regler mit Proportionalintegralableitung geregelt und auf 37 °C gehalten. Ein Thermoelement vom Typ K wird zwischen den Chip und die ITO-Heizung geklemmt, um die Temperatur der Zellkulturbereiche innerhalb des Chips zu überwachen. Der MOE-Chip ist auf einem programmierbaren X-Y-Z-Motortisch installiert und eignet sich für die automatische Zeitraffer-Bilderfassung an einzelnen Kanalabschnitten. Die Herstellung der ITO-Heizung und der Aufbau des Zellkultur-Heizsystems wurden bereits beschrieben.
2. Infundiere die mNPCs, indem du sie manuell über den Mediumauslass in den MOE-Chip pumpst. Inkubieren Sie den zellbesiedelten MOE-Chip 4 h lang auf der 37 °C heißen ITO-Heizung.
3. Nach 4 h wird das gesamte Medium mit einer Spritzenpumpe bei einer Durchflussmenge von 20 μL/h durch den MOE-Chip über den Mediumeinlass gepumpt.
   Anmerkung: Die mNPCs werden gezüchtet und für weitere 24 Stunden im Chip gehalten, bevor sie durch elektrische Felder (EF) stimuliert werden, um die Zellanhaftung und das Zellwachstum zu ermöglichen. Die Abfallflüssigkeit wird in einer leeren 5-ml-Spritze aufgefangen, die mit dem 3-Wege-Absperrhahn des Auslasses verbunden ist und in Abbildung 6A als "Abfall" dargestellt ist. Die Konfiguration des mikrofluidischen MOE-Systems ist in Abbildung 6 dargestellt. Dieses mikrofluidische System sorgt für eine kontinuierliche Versorgung der Zellen mit Nährstoffen. Das gesamte frische Medium wird kontinuierlich in den MOE-Chip gepumpt, um einen konstanten pH-Wert zu halten. Daher können die Zellen außerhalb eines CO₂ -Inkubators kultiviert werden.
4. Verwenden Sie elektrische Drähte, um einen EF-Multiplexer über die Ag/AgCl-Elektroden auf dem Chip mit dem MOE-Chip zu verbinden. Schließen Sie einen EF-Multiplexer und einen Funktionsgenerator an einen Verstärker an, um Rechteck-Gleichstromimpulse mit einer Größe von 300 mV/mm bei einer Frequenz von 100 Hz bei 50 % Tastverhältnis (50 % Einschaltzeit und 50 % Ausschaltzeit) auszugeben (Abbildung 6B).
   1. Verbinden Sie die elektrischen Drähte mit dem EF-Multiplexer. Verbinden Sie die elektrischen Drähte über die Ag/AgCl-Elektroden mit dem MOE-Chip.
   2. Verbinden Sie den EF-Multiplexer über elektrische Kabel mit dem Verstärker. Verbinden Sie den Funktionsgenerator mit dem Verstärker und dem digitalen Oszilloskop.
      Anmerkung: Der EF-Multiplexer ist eine Schaltung, die die Impedanz der Kulturkammer in die Schaltung einbezieht und alle einzelnen Kammern in einem parallelen elektronischen Netzwerk verbindet. Jede der drei Kulturkammern ist elektrisch in Reihe mit einem variablen Widerstand (Vr) und einem Amperemeter (in Abbildung 6A dargestellt) im Multiplexer geschaltet. Der elektrische Strom durch jede Kulturkammer wird durch Steuerung des VR variiert, und der Strom wird auf dem entsprechenden Amperemeter angezeigt. Die elektrische Feldstärke in jeder Zellkulturregion wurde nach dem Ohmschen Gesetz berechnet, I= σEA, wobei I der elektrische Strom, σ (eingestellt als 1,38 S·^m-1 für DMEM/F12) die elektrische Leitfähigkeit des Kulturmediums, E das elektrische Feld und A die Querschnittsfläche der elektrotaktischen Kammer ist. Für die in Abbildung 1 gezeigte Dimension des Zellkulturbereichs beträgt der elektrische Strom ~87 mA und ~44 mA für DC- und DC-Impuls bei 50 % Tastverhältnis.
5. Die mNPCs werden 48 Stunden lang quadratischen Gleichstromimpulsen mit einer Größenordnung von 300 mV/mm bei einer Frequenz von 100 Hz ausgesetzt. Das gesamte Medium wird kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 10 μL/h gepumpt, um die Zellen ausreichend mit Nährstoffen zu versorgen und einen konstanten pH-Wert im Medium zu halten.

Ergebnisse

Abbildung 1: Die detaillierte Konfiguration des optisch transparenten mehrkanaligen elektrotaktischen Chips.(A) Explosionszeichnung der MOE-Chipbaugruppe. Der MOE-Chip besteht aus PMMA-Platten (50 mm x 25 mm x 1 mm), doppelseitigem Klebeband (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), Adaptern (10 mm x 10 mm x 6 mm), optischem PMMA-Blech (50 mm x 75 mm x 3 mm), doppelseitigem Klebeband (24 mm x 60...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3)	Bht	K2R20	Polymethylmethacrylat (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL Kunststoff-Röhrchen	Verifizierter Lieferant - Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Röhrchen mit konischem Boden und Kappe, montiert, vorsterilisiert
3 mL Spritze	TERUMO	DVR-3413	3 mL Spritzen zum Einnehmen, ohne Nadel
3 mm optisches PMMA (Schicht 5)	CHI MEI GmbH	ACRYPOLY PMMA-Platte	PMMA in optischer Qualität
3-Wege-Absperrhahn	NIPRO	NCN-3L	Steriler Einweg-3-Wege-Absperrhahn
5 mL Spritze	TERUMO	DVR-3410	5 mL Spritzen zum Einnehmen, ohne Nadel
Adapter	Verifizierter Lieferant - Dong Zhong Co., Ltd.	Angepasst	PMMA-Adapter
Agarose	Sigma-Aldrich	Nr. A9414	Agarose, niedrige Geliertemperatur
Verstärker	A.A. Laborsysteme GmbH	A-304	Hochspannungsverstärker
AutoCAD-Software	Autodesk	Pädagogische Version	Abfassung
B-27 Zuschlag	Gibco	Artikel-Nr.: 12587-010	B-27 Supplement (50x), minus Vitamin A
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Auch rekombinante humane FGF-basic genannt
Schwarzer Gummistopfen	TERUMO	DVR-3413	Ab 3 mL Spritzen zum Einnehmen, ohne Nadel
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr. B4287	Blockierendes Reagenz
Zentrifuge	HSIANGTAI	CV2060	Zentrifuge
CO2-Laser-Ritzer	Laser Tools und Technics Corp.	ILS-II	Gekauft bei http://www.lttcorp.com/index.htm
Konus-Verbinder	IDEX Gesundheit & Wissenschaft	F-120X	Einteilige fingertight 10-32 konisch, für 1/16" AD natur
Cone-Luer-Adapter	IDEX Gesundheit & Wissenschaft	P-659	Luer-Adapter 10-32 Buchse auf Buchse Luer, PEEK
Konfokales Fluoreszenzmikroskop	Leica Mikrosysteme	TCS SP5	Leica TCS SP5 Benutzerhandbuch, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digitalkamera	Olymp	Nr. E-330	Automatische Zeitraffer-Bilderfassung
Digitales Oszilloskop	Tektronix	TDS2024	Messen Sie Spannungs- oder Stromsignale über die Zeit in einer elektronischen Schaltung oder Komponente, um Amplitude und Frequenz anzuzeigen.
Doppelseitiges Klebeband	3M	PET 8018	Gekauft bei http://en.thd.com.tw/
Dulbecco's modifiziertes Adlermedium/Schinken Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, Pulver, HEPES
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, Pulver, kein Kalzium, kein Magnesium
EF-Multiplexer	Verifizierter Lieferant - Asiatic Sky Co., Ltd.	Angepasst	Überwachen und steuern Sie den elektrischen Strom in einzelnen Kanälen
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Auch rekombinanter humaner EGF genannt
Schnell wirkender Cyanacrylat-Kleber	3M	7004T	Festigkeit Sofortkleber (flüssig)
Anschluss mit flachem Boden	IDEX Gesundheit & Wissenschaft	P-206	Flanschlose Außenmutter Delrin, 1/4-28 flacher Boden, für 1/16" AD blau
Funktionsgenerator	Agilent Technologien	33120A	Leistungsstarker synthetisierter 15-MHz-Funktionsgenerator mit integrierter Arbiträrsignalfunktion
Indium-Zinn-Oxid (ITO)-Glas	Merck	300739	Für ITO-Heizung
Thermoelement vom Typ K	Tecpel	TPK-02A	Temperatur-Thermoelemente
Luer-Adapter	IDEX Gesundheit & Wissenschaft	Nr. P618-01	Luer-Adapter weiblich Luer auf 1/4-28 Stecker Polypropylen
Luer-Lock-Spritze	TERUMO	DVR-3413	Für Agar-Salzbrücken
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Grundlegendes Leben	BL2651	Waschlösung
Poly-L-Lysin (PLL)	Sigma	Nr. P4707	Beschichtungslösung
Präzisions-Deckgläser Dicke Nr. 1,5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmierbarer X-Y-Z-Motortisch	Tanlian Inc	Angepasst	Gekauft bei http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional-Integral-Ableitungs-Regler (PID)	Toho Elektronik	TTM-J4-R-AB	Temperaturregler
PTFE-Schlauch	Professional Plastics Inc. Niederlassung in Taiwan	Außendurchmesser 1/16 Zoll	Weißer, durchscheinender PTFE-Schlauch
Spritzenpumpe	New Era Systems Inc	NE-1000	NE-1000 programmierbare Einzelspritzenpumpe
TFD4-Reinigungsmittel	FRANKLAB	TFD4	Reiniger für Deckglas
Thermischer Bonder	Kuan-MIN Tech Co.	Angepasst	Gekauft bei http://kmtco.com.tw/
Ultraschall-Reiniger	Löwe	LEO-300S	Ultraschall-Steri-Reiniger
Vakuumkammer	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Vakuum-Trockenschrank
Weißer fingerfester Stecker	IDEX Gesundheit & Wissenschaft	P-316	1/4-28 mit flachem Boden, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html