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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über den Arbeitsablauf dieses Protokolls.
>1. Neuprogrammierung und Wartung von iPSCs
- Sammeln Sie 8 ml Blut des Probanden (alter oder kranker Patient; Alter 65 und älter) in Zellvorbereitungsröhrchen (CPT) mit Natriumcitrat oder in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder heparinisierte Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 1.800 x g, um Pellets zu sammeln, die nur peripheres Blut und kein Serum enthalten.
- Verwenden Sie spezielle Reprogrammierungsvektoren gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle), um iPSCs zu erhalten.
- Kultur-iPSCs in Feeder-freien, Laktose-Dehydrogenase-Elevating-Virus (LDEV)-freien Basalmembran-Matrix-beschichteten 6-Well-Kulturplatten in Essential 8 (E8)-Medien (siehe Materialtabelle) bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.
- Halten Sie iPSCs für 3-4 Tage im E8-Medium, um eine Überfüllung oder spontane Differenzierung zu vermeiden.
- Validieren Sie die Pluripotenz der iPSC-Linien mit Immunfluoreszenzmarkern (Schritt 2) und testen Sie auf Mykoplasmen (Schritt 3).
>2. Pluripotenz-Färbung
- Um Lösungen und Antikörper zu konservieren, säen Sie die Zellen 3-4 Tage vor der Analyse auf beschichtete (Schritt 1.4) 24-Well-Kulturplatten. Aspirieren Sie das Medium mit einer Pipette und fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) für 15-20 Minuten bei RT.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit 1x PBS und permeabilisieren Sie mit 0,1% Triton-X 100 in 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für mindestens 15 min, jedoch nicht länger als 1 h bei RT.
- 3x mit 1x PBS waschen und mit 5% BSA in PBS für 30 min bei RT blocken.
- Nochmals 3x mit 1x PBS waschen und die Antikörper Sox2 und Oct3/4 (1:100 Verdünnung; siehe Materialtabelle) sowie den Nukleinsäurefärbemittel DAPI in 1% BSA (1:4.000 Verdünnung) über Nacht bei 4 °C zugeben. Zum Schutz vor Licht in Alufolie einwickeln.
- 3x mit 1x PBS waschen und die Zellen in PBS belassen. Aufnahme mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 10-20-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Pluripotenzmarker der geschlechtsbestimmenden Region Y-Box 2 (Sox2) und des Octamer-bindenden Transkriptionsfaktors 3/4 (Oct3/4) in den Zellkernen lokalisiert sind.
>3. Mykoplasmen-Tests
HINWEIS: Detaillierte Informationen zur Durchführung und Analyse finden Sie im Protokoll des Nachweiskits (siehe Materialtabelle). Das Nachweiskit enthält das Reagenz, das Substrat und den Assay-Puffer für Mykoplasmentests.
- Vor dem Passieren von Zellen oder Auffrischungsmedium werden 2-3 ml Zellkulturmedium in einem Zentrifugenröhrchen gesammelt und alle Zellen oder Ablagerungen bei 200 x g für 5 Minuten bei RT pelletiert. Lagern Sie den Überstand ≤5 Tage lang bei 4 °C. Inkubieren Sie die Zellen mindestens 24 Stunden lang mit dem Medium, um ein nachweisbares Signal zu gewährleisten.
- Geben Sie 100 μl Zellüberstand in ein frisches Röhrchen oder eine Vertiefung einer weißwandigen 96-Well-Platte (undurchsichtiger Boden empfohlen, siehe Materialtabelle). Rekonstituieren Sie das Reagenz und das Substrat im Assay-Puffer und äquilibrieren Sie es 15 Minuten lang bei RT.
- Geben Sie 100 μl des Reagenzes in die Probe und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei RT. Messen Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer (Messung #1).
- Geben Sie 100 μl des Substrats in die Probe und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei RT. Messen Sie die Lumineszenz (Messung #2).
- Bestimmen Sie die Mykoplasmenkontamination durch das Verhältnis von Messung #2 zu #1. Beziehen Sie sich zur Interpretation der Ergebnisse auf das Handbuch des Kits.
>4. Mikrofilament-Vorbereitung
- Beginnen Sie mit der Präparation der Poly-(Milchsäure-Co-Glykolsäure) (PLGA, siehe Materialtabelle), indem Sie den Nahtstrang mit dem stumpfen Ende eines Skalpells ausfransen. Bestreichen Sie die ausgefranste Faser leicht mit 70% Ethanol.
- Beginnen Sie unter dem Mikroskop und mit einem Lineal damit, die PLGA-Faser in Fragmente von 500 μm bis 1 mm langen Strängen zu schneiden. Schneiden Sie insgesamt ca. 25 mm der Faser ab. Bewahren Sie die Filamente in einem 15-ml-Röhrchen mit einer 1-ml-Antibiotika-Antimykotika-Lösung auf.
- Verdünnen Sie die Faserlösung in der Haube mit 10 mL DMEM/F-12 (Tabelle 1). Gut einreiben, um die Lösung zu vermischen.
Anmerkung: Arbeiten Sie in einer Zellkultur-Durchflusshaube in einer sterilen Umgebung.
- Geben Sie 20 μl der Faserlösung in drei Vertiefungen des Embryoidkörpers (EB), die Vertiefungen einer 96-Well-Platte bilden. Unter Hellfeldmikroskopie die Fasern pro Vertiefung zählen und mitteln. Verdünnen oder konzentrieren Sie auf durchschnittlich 5-10 PLGA-Mikrofilamente pro Well. Bereiten Sie jedes gut auf diese Weise vor.
- Die Vertiefungen sind nun bereit, mit Zellen besiedelt zu werden. Lagern Sie die Platte bis zur Verwendung bei Raumtemperatur oder bei 4 °C für den nächsten Tag.
>5. Bildung des Embryoidkörpers (EB)
HINWEIS: Alle Medien und Lösungen müssen auf RT erwärmt werden.
- Sobald die iPSCs eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben (Abbildung 2A), sind sie bereit, durchgelassen und für die EB-Bildung verwendet zu werden. Überprüfen Sie die Zellen mit einem Mikroskop bei 10-20-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien minimale (<10%) Bereiche spontaner Differenzierung aufweisen.
- Aspirieren Sie das Medium mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen einmal mit Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline (DPBS). Dissoziieren Sie die Kolonien durch Zugabe von 500 μl Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) oder 0,5 mM EDTA und inkubieren Sie sie für 3-5 min bei 37 °C.
Anmerkung: Arbeiten Sie in einer Zellkultur-Durchflusshaube in einer sterilen Umgebung.
- Sammeln Sie die freigesetzten Zellen, indem Sie 1 ml frisches E8-Medium in jede Vertiefung geben und vorsichtig pipettieren, bis sich alle Zellen gelöst haben.
- Übertragen Sie 1,5 ml Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und fügen Sie weitere 1 ml frisches E8-Medium hinzu, um ein Gesamtvolumen von 2,5 ml zu erreichen.
- Zentrifugieren Sie bei 290 x g für 3 min bei RT.
- Aspirieren Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Essential 6 (E6, siehe Materialtabelle), das mit einem 50 μM Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor ergänzt wird, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Bereiten Sie eine Zellsuspension von 60.000-90.000 Zellen/ml, abhängig von der gewünschten Aussaatdichte, in E6-Medien vor, die mit 50 μM ROCK-Inhibitor ergänzt sind (siehe Materialtabelle).
- Geben Sie 150 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-ULA-Platte (Ultra-Low Attachment) (oder einer vorbereiteten konkaven Platte). Aussaat von 9.000 bis 11.000 Zellen pro Well.
- Die Platte zentrifugieren, um die Zellen bei 290 x g für 1 min bei RT zu aggregieren. Die Platte bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 in den Inkubator stellen.
>6. Neuroepitheliale Induktion
- Nach 24 h werden vorsichtig 120 μl des Mediums mit einer Pipette aspiriert. Achten Sie darauf, dass Sie das EB nicht aspirieren, indem Sie die Pipettenspitze zu weit in die Vertiefung absenken.
- Fügen Sie 150 μl E6-Medium (bei RT) hinzu, ergänzt mit 2 μM XAV939 und dem Suppressor of Mothers against Decapentaplegic (SMAD)-Inhibitoren: 10 μM SB431542 und 500 nM LDN 193189 pro Vertiefung (siehe Materialtabelle).
- Wechseln Sie das Medium täglich durch frisch vorbereitete E6-Medien, die mit 2 μM XAV939, 10 μM SB431542 und 500 nM LDN 193189.
Anmerkung: Am Tag 6 (DIV6) sollten die EBs einen Durchmesser von 550-600 μm haben und bereit für die weitere Differenzierung sein.
>7. Differenzierung und Reifung von Organoiden
HINWEIS: Alle Medien müssen auf RT erwärmt werden.
- Bei etwa DIV7 ist zu prüfen, ob alle EBs einen Durchmesser von 550-600 μm erreicht haben und eine glatte und klare Kante aufweisen (Abbildung 2B); zu diesem Zeitpunkt sind sie bereit, in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet zu werden.
Anmerkung: Arbeiten Sie in einer sterilen Umgebung.
- Bereiten Sie Noppeneinbettungsplatten aus der thermoplastischen Siegelfolie vor (siehe Materialtabelle), indem Sie eine Folienfolie (ca. 4 Zoll lang) auf eine leere P200-Schachtel legen. Drücken Sie das Folienblatt mit einem konischen 15-ml-Röhrchen oder einem 500-μl-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig in die Löcher, um 12 Grübchen zu erzeugen. Sprühen Sie die Folienbahn mit 70% Ethanol ein und lassen Sie sie in der Strömungshaube bei eingeschaltetem UV-Licht mindestens 30 min trocknen.
Tauen Sie - eine ausreichende Menge Basalmembranmatrix (Matrigel, siehe Materialtabelle) auf Eis auf und legen Sie sie in die Strömungshaube.
Anmerkung: Pro EB werden ca. 30 μl unverdünnte Membranmatrix benötigt. Halten Sie die Membranmatrix immer unter 4 °C, um ein Gelieren zu verhindern. Vorgekühlte Pipettenspitzen werden ebenfalls empfohlen, da sie die Polymerisation der Matrix in der Spitze während des Pipettierens verlangsamen und dadurch den Materialverlust reduzieren.
- Übertragen Sie mit einer P200-Spitze mit breiter Bohrung ein EB auf jedes Grübchen und entfernen Sie so viel Medium wie möglich mit einer normalen Pipettenspitze. Achten Sie darauf, die EBs nicht trocknen zu lassen. Geben Sie mit einer normalen P200-Spitze ~30 μl unverdünnte Membranmatrix zu jedem Organoid und stellen Sie sicher, dass sich das EB in der Mitte des Tröpfchens befindet.
- Sobald alle EBs in die Matrix eingebettet sind, legen Sie die Folienfolie mit den EBs in eine sterile Petrischale.
Anmerkung: Optional kann in der größeren Petrischale neben der Folienfolie eine kleine, mit sterilem Wasser gefüllte Petrischale platziert werden, um eine Verdunstung zu verhindern.
- Die Schale in einen Inkubator umstellen und bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 ca. 10 min inkubieren, damit sich die Membranmatrix verfestigen kann.
- Bereiten Sie für jeden Satz von 12 eingebetteten Organoiden 5 ml Differenzierungsmedium mit B27 ohne Vitamin A (Tabelle 1) in einer Vertiefung einer ULA 6-Well-Platte vor. Die Platte in einem Inkubator auf 37 °C vorwärmen.
- Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, übertragen Sie die eingebetteten EBs auf die ULA 6-Well-Platte, indem Sie die Folienfolie nehmen und die Grübchen von der Rückseite der Folie herausdrücken. Falls erforderlich, entnehmen Sie 1 ml aus der Vertiefung und pipettieren Sie es auf das Blatt, damit sich die Tröpfchen von der Folie lösen können.
Anmerkung: Wichtige morphologische Veränderungen sind 1 Tag nach der Einbettung zu sehen; EBs entwickeln sich von glatten Kanten zu prallen Vorsprüngen, die Knospen bilden (Abbildung 2C).
- Führen Sie nach 2 Tagen (DIV9) einen halben Medienwechsel durch. Achten Sie darauf, dass Sie die Tröpfchen der Membranmatrix dabei nicht ansaugen oder beschädigen.
- Nach weiteren 2 Tagen (DIV11) ist ein vollständiger Medienwechsel durchzuführen und das Medium mit 3 μM CHIR99021 zu ergänzen (siehe Materialtabelle).
- Bei DIV14 wird das Medium auf Differenzierungsmedien mit B27 mit Vitamin A umgestellt (Tabelle 1), um die Organoidgröße allmählich zu erhöhen.
- Platzieren Sie die Well-Platte bei DIV16 auf einem Orbitalschüttler bei 90 U/min in einem Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
- Verdünnen Sie alle 40 DIV 500 μl der Membranmatrix pro 50 ml Medium für zusätzliche Nährstoffe im Medium.
Tabelle 1: Zusammensetzung der in der vorliegenden Studie verwendeten Differenzierungsmedien.
| Reagenz | Endkonzentration | Volumen (50 mL insgesamt) |
| DMEM-F12 | 50% | ca. 25 mL |
| Neurobasales Medium | 50% | ca. 25 mL |
| N2 Zuschlag (100x) | 1x | 0,25 mL |
| B27 Ergänzung -/+ Vitamin A (50x) | 0,5-fach | 0,5 mL |
| Insulin | 0,25 % | 12,5 μl |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 mL |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5-fach | 0,25 mL |
| HEPES (1 M) | ca. 10 mM | 0,5 mL |
| Antibiotikum/Antimykotikum (100x) | 1x | 0,5 mL |
| 2-β-Mercaptoethanol | 50 μM | 17,5 μL |
| HINWEIS: Einige DMEM-F12 enthalten bereits GlutaMAX, es muss kein weiteres hinzugefügt werden. |
