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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Dissektion von Embryonen und Dissoziation von Gewebe
- Halten Sie erwachsene weibliche Ratten (200-250 g) bei konstanter Temperatur (22 ± 1 °C) und relativer Luftfeuchtigkeit (50 %) nach einem regulären Hell-Dunkel-Zeitplan (Licht 7 bis 19 Uhr) in der Tieranlage. Stellen Sie sicher, dass Futter und Wasser frei verfügbar sind.
- Betäuben Sie eine trächtige weibliche Ratte nach 18 Tagen Entwicklung (E18) mit 3% Isofluran. Opfern Sie dann das Tier durch Gebärmutterhalsluxation.
- Entnehmen Sie die Hippocampi von jedem Rattenembryo und legen Sie sie in die eiskalte Salzlösung von Hank ohne Ca2+ und Mg2+. Am 18. Tag der Entwicklung sind das Gewebe des Hippocampus und der Hirnrinde sehr weich und müssen nicht in kleine Stücke geschnitten werden. Weitere Details finden Sie hier.
- Dissoziieren Sie das Gewebe in 0,125 % Trypsin/Hank-Lösung, die 0,05 % DNAse enthält, für 18-20 min bei 37 °C.
- Entfernen Sie die überstehende Lösung mit einer Pasteurpipette und stoppen Sie den enzymatischen Aufschluss, indem Sie 5 Minuten lang Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) hinzufügen.
- Entfernen Sie das Medium mit FBS und waschen Sie es einmal mit dem Medium mit seinem Ergänzungsmittel, 1% L-Glutamin, Gentamicin 10 μg/ml. Entfernen Sie das Medium wieder mit einer Pasteur-Pipette und füllen Sie es erneut mit einer kleinen Menge (500 μl) Wachstumsmedium mit seinem Ergänzungsmittel, 1% L-Glutamin, Gentamicin 10 μg/ml.
- Dissoziieren Sie das Gewebepellet mechanisch mit einer schmalen Pasteurpipette, bis eine milchige Suspension der Zellen erkennbar ist. Es ist nicht notwendig, die Zellsuspension zu zentrifugieren.
- Verdünnen Sie das kleine Volumen der Zellsuspension mit dem Wachstumsmedium, um ein Endvolumen von 2,0 ml zu erhalten. Zählen Sie die erhaltene Zellkonzentration mit einer Hämozytometerkammer. Verdünnen Sie diese Konzentration im Verhältnis 1:5, um die gewünschte Zellkonzentration von 600-700 Zellen/μl zu erhalten.
>2. Galvanisieren von Zellen
- Plattenzellen mit einer Dichte von etwa 2.000 Zellen/mm2 auf den aktiven Bereich des MEA, definiert durch die PDMS-Einschränkung, um ein neuronales 2D-Netzwerk zu erstellen.
Anmerkung: Jeder Hippocampus enthält etwa 5 x 105 Zellen (1 x 106 für einen einzelnen Embryo). Präparieren Sie 6 Embryonen, um eine Gesamtmenge von 6 x 106 Zellen in 2 ml und eine geschätzte Konzentration von 3.000 Zellen/μl zu erhalten. Verdünnen Sie diese Konzentration im Verhältnis 1:5, um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten, und plättieren Sie etwa 600-700 Zellen/μl. Wenn die MEA-Fläche, die durch die PDMS-Beschränkung begrenzt wird, etwa 7,065 mm2 und die Gesamtzahl der plattierten Zellen 600 Zellen/μl x 24 μl = 14.400 Zellen beträgt, ergibt sich die endgültige Dichte von 2.038 Zellen/mm2.
- Stellen Sie die MEA-Geräte in den Inkubator mit befeuchteter CO2 -Atmosphäre (5%) bei 37 °C.
- Verteilen Sie 160 μl der Suspension mit einer Zellkonzentration von 600-700 Zellen/μl (ca. 100.000 Zellen) auf die Oberfläche der Mikrokügelchen-Monoschicht, die sich innerhalb der Multiwell-Platten befindet, um den vorbereitenden Schritt für den Aufbau der dreidimensionalen Kultur abzuschließen. Stellen Sie die Multiwell-Platten in den Inkubator mit befeuchteter CO2 -Atmosphäre (5%) bei 37 °C.
>3. 3D Aufbau neuronaler Netzwerke
- 6-8 Stunden nach dem Plattieren übertragen Sie die Suspension (Mikrokügelchen mit Neuronen) von den Multiwell-Platten sehr vorsichtig in den durch die PDMS-Einschränkung abgegrenzten Bereich, indem Sie ein Pipettenset für ein Volumen von etwa 30-40 μl verwenden. Warten Sie nach jedem Transfer etwa eine halbe Minute, damit sich die Mikrokügelchen in einer hexagonalen, kompakten Struktur zusammenfügen können.
- Sobald alle Schichten abgeschieden und spontan zusammengesetzt sind, füllen Sie den oberen Rand des durch die PDMS-Einschränkung begrenzten Bereichs mit einem großen Tropfen von etwa 300 μl Medium auf.
- Legen Sie die 3D-Struktur gekoppelt an die MEA für 48 Stunden in den Inkubator (T = 37,0 °C, CO2 = 5%), bevor Sie ein endgültiges Volumen (ca. 1 ml) der Wachstumsmediumkultur mit der Zugabe hinzufügen.
Anmerkung: Berücksichtigen Sie die Gesamtzahl der Beads auf den Multiwell-Platten mit Membraneinsatz (30.000) und die Anzahl der Beads auf einer einzelnen Schicht auf dem MEA-Gerät (6.000). Die resultierende 3D-Struktur besteht aus 5 Schichten von Mikrokügelchen und Zellen. Wenn man bedenkt, dass das neuronale 3D-Netzwerk geometrisch nicht perfekt ist, könnte die resultierende 3D-Struktur aus 5-8 Schichten bestehen.
- Geben Sie am Tag nach dem Plattieren vorsichtig das endgültige Volumen des Mediums (ca. 900 μl) in den MEA-Ring. Halten Sie die 3D-Kulturen in einer befeuchteten CO2 -Atmosphäre (5%) bei 37 °C für 4-5 Wochen. Tauschen Sie die Hälfte des Mediums einmal pro Woche aus.