Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Präparation und Kultivierung kortikaler Astrozyten
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte des Protokolls mindestens 7 Tage ab, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren, da sich die Astrozytenkulturen zu konfluenten Monoschichten entwickeln sollten, bevor die Neuronen vorbereitet werden. Primäre Astrozyten stammen aus gemischten Gliakulturen, die von Mausjungtieren um den postnatalen Tag (P) 0-3 gewonnen wurden. Es sind drei Gehirne (6 Kortikale) pro T75-Kolben zu verwenden.
- Bereiten Sie das Astrozytenmedium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) unter sterilen Bedingungen mit 10 % v/v Pferdeserum und 0,1 % v/v Gentamicin ergänzen. Lagern Sie das Medium bis zu 2 Wochen bei 4 °C.
- 3x T75 Kolben mit 10 μg/ml Poly-D-Lysin (PDL; in Wasser in Zellkulturqualität) für mindestens 1 h bei 37 °C in Gegenwart von 6 % v/v CO2 bestreichen. Waschen Sie die Kolben nach dem Überziehen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um ungebundene Kationen zu entfernen, und fügen Sie 9 ml Astrozytenmedium hinzu.
- Für die Vorbereitung des Gehirns geben Sie 10 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in 1x 10 cm Petrischale und 1 mL HBSS in 1x 15 mL Röhrchen (unabhängig von der Anzahl der Gehirne, die verwendet werden). Halten Sie für den Eingriff eine chirurgische Schere, 2 feine Pinzetten und ein Fernglas in Reichweite.
- 3 Welpen schnell mit der OP-Schere enthaupten und die Köpfe in einer leeren 10 cm Schale einsammeln.
- Führen Sie die Vorbereitung der Kortikale unter dem Fernglas durch. Entfernen Sie mit zwei feinen Zangen die Rückenhaut vom Schädel an der Mittellinie, beginnend vom Hals bis zur Höhe der Augen. Danach ist unter dem Schädel das Gehirn mit seinen Blutgefäßen sichtbar.
- Fixieren Sie den Kopf mit einer Pinzette am rostralen Ende und schneiden Sie die Mittellinie des Schädels ein, beginnend am hinteren Ende. Schneiden Sie anschließend die rechte und die linke Schädelhälfte ab, um das Gehirn freizulegen.
- Schließen Sie die Spitze der Pinzette und positionieren Sie sie ventral unter dem Gehirn. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel und übertragen Sie es in die HBSS-gefüllte 10 cm Petrischale. Mit der restlichen Probe wird auf die gleiche Weise verfahren, bis alle Gehirne in der Schale gesammelt sind.
- Nachdem Sie das Gehirn entnommen haben, beginnen Sie mit der Trennung der Rinden, indem Sie das Hinterhirn mit einer Pinzette wie einer Schere abkneifen. Führen Sie mit einer Pinzette einen Schnitt in der Mittellinie zwischen den beiden Hemisphären durch. Fixieren Sie das Gehirn vorsichtig mit einer Pinzette und schneiden Sie das Mittelhirn und die Riechkolben mit einer zweiten Pinzette ab, um bei den kortikalen Hälften zu landen.
- Fixieren Sie eine kortikale Hälfte mit einer Pinzette und schälen Sie die Hirnhäute von den Hemisphären, indem Sie sie vom lateralen Rand lösen und anschließend mit einer zweiten Pinzette von der kortikalen Oberfläche ziehen.
- Drehen Sie die kortikale Hälfte mit der Oberfläche nach unten zur Schale hin um; präzieren und entfernen Sie vorsichtig den halbmondförmigen Hippocampus mit einer Pinzette. Übertragen Sie die einzelnen Kortexe mit einer geschlossenen Pinzette in das konische 15-ml-Röhrchen, um einen einzelnen Kortex zu tragen.
- Nachdem Sie alle Kortikale gesammelt haben, gehen Sie in die sterile Laminar-Flow-Haube und beginnen Sie mit den Vorbereitungen für die Dissoziation des kortikalen Gewebes.
- Geben Sie 1 mL DMEM in ein 2 mL Reaktionsröhrchen und fügen Sie 0,1 % w/v Papain (30 Einheiten) hinzu. Die Suspension wird in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert, bis eine geklärte Lösung entsteht (ca. 3 min). 0,24 mg/ml L-Cystein und 20 μg/ml DNAse zugeben und vorsichtig schütteln.
HINWEIS: Für die Verdauung wird ca. 1 ml Enzymlösung benötigt.
- Filtrieren Sie (0,22 μm Porengröße), um 1 ml sterile Lösung zu erhalten, bevor Sie sie dem kortikalen Gewebe zuführen. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 min - 1 h bei 37 °C (d.h. im Wasserbad).
HINWEIS: Die Schritte 1.11 - 1.14 sind kritisch und sollten innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein.
- Um die Verdauungsreaktion zu beenden, fügen Sie 1 ml Astrozytenmedium hinzu und zerkleinern Sie das verdaute Gewebe vorsichtig mit einer 1 ml-Pipette. Bewegen Sie zum Verreiben den Pipettenkolben vorsichtig und saugen Sie dabei die kortikale Gewebesuspension an und extrudieren Sie sie.
- Sobald das Gewebe in eine einzellige Suspension dissoziiert wurde, fügen Sie 5 ml Astrozytenmedium hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 216 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig aus dem resultierenden Pellet und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Astrozytenmedium.
- Die Zellsuspensionen werden in T75-Kolben gegeben, die mit 9 ml Astrozytenmedium aufgefüllt sind (siehe 1.2).
- Die Zellen werden bei 37 °C im Inkubator in Gegenwart von 6 % v/v CO2 inkubiert. Nach 4 Tagen ist der erste vollständige Medienwechsel (10 mL) durchzuführen. Wechseln Sie danach das Nährmedium alle 2 - 3 Tage.
- Überprüfen Sie nach 7 Tagen, ob die Zellen eine konfluente Monoschicht gebildet haben. Wenn nicht, warten Sie weitere 2 - 3 Tage, bis die vollständige Konfluenz der Kultur erreicht ist.
HINWEIS: Astrozyten weisen große, abgeflachte Zellkörper auf, lokalisieren sich am Boden des Kolbens und entwickeln keine nennenswerten zellulären Prozesse. Sie unterscheiden sich von den kleinen phasenkontrastreichen hellen Vorläuferzellen und Mikroglia, die sich auf der Monoschicht befinden.
- Um die Vorläuferzellen loszuwerden und eine reine Astrozytenkultur zu erhalten, stellen Sie die T75-Kolben auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie die Kulturen O/N bei 250 U/min. Es ist darauf zu achten, dass die Temperatur auf 37 °C eingestellt ist und dass der Filter des Kolbens mit Laborfolie verschlossen ist, um ein Verdampfen des CO2 zu verhindern.
- Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 10 ml frisches Kulturmedium hinzu, das mit 20 μM Cytosin-1-β-D-Arabinofuranosid (AraC) aufgefüllt ist, um verbleibende sich teilende Zellen zu eliminieren.
HINWEIS: Eine Inkubation mit AraC für 2 - 3 Tage im Inkubator bei 37 °C, 6% CO2 führt zu einer reinen Astrozytenkultur.
- Überwachen Sie die Reinheit der Astrozytenkulturen durch visuelle Inspektion unter dem Lichtmikroskop. Wenn sich verbleibende helle Vorläuferzellen und Mikroglia mit Phasenkontrast noch auf der astrozytären Monoschicht befinden (siehe Schritt 1.16), wiederholen Sie die Schritte 1.18 und 1.19.
HINWEIS: Die konfluenten und reinen Astrozyten-Monoschichten können bis zu 14 Tage im Inkubator (37 °C, 6 % v/v CO2) aufbewahrt werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Wechseln Sie alle 3 Tage die Hälfte des Mediums. Sammeln, frieren und tauen Sie die Astrozyten nicht auf, da diese Zellen durch den Lagervorgang ihre neuronalen unterstützenden Eigenschaften verlieren.
>2. Vorbereitung von Astrozyten für die indirekte Kokultur
HINWEIS: 48 - 72 h bevor die Neuronen vorbereitet werden, Astrozyten auf die Zellkultur-Inserts übertragen. Im Allgemeinen liefert ein einzelner T75-Kolben eine ausreichende Anzahl von Zellen, um die mit einem Präparat gewonnenen neuronalen Kulturen zu unterstützen.
- Platzieren Sie so viele Einsätze wie nötig in 24-Well-Platten. Beschichten Sie jeden Einsatz mit 10 μg/ml PDL (gelöst in Wasser in Zellkulturqualität) für ca. 1 h bei 37 °C, 6 % v/v CO2. Waschen Sie die Einlagen nach der Inkubation zweimal mit PBS. Fahren Sie in der Zwischenzeit mit der Aufbereitung der Astrozyten fort.
HINWEIS: Die mit PBS gefüllten Einsätze können aufbewahrt werden, bis die Astrozytenzellsuspension gebrauchsfertig ist.
- Aspirieren Sie das Astrozytenmedium (mit AraC) und waschen Sie die Kultur einmal mit 10 ml PBS, um sicherzustellen, dass alle Serumreste entfernt werden.
- Geben Sie 3 ml 0,05 % Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in die Kolben und inkubieren Sie die Zellen für die Trypsinisierung bei 37 °C, 6 % v/v CO2 für ca. 10 min.
- Kontrollieren Sie die Zellablösung durch Sichtprüfung mit einem Mikroskop und erleichtern Sie die Ablösung der Zellen, indem Sie mit der Seite der Kolben gegen den Schreibtisch klopfen.
HINWEIS: Die Schritte 2.5 - 2.8 sind kritisch und sollten innerhalb von 15 - 20 Minuten abgeschlossen sein.
- Nach der Trypsinisierung resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 7 mL Astrozytenmedium und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15 mL Röhrchen. 5 min bei 216 x g zentrifugieren.
- Den Überstand vorsichtig aspirieren und das Zellpellet in 1 ml Astrozytenmedium resuspendieren.
- Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer.
- Füllen Sie den Boden der Wells der 24-Well-Platte mit 500 μl Astrozytenmedium und überführen Sie 25.000 Zellen in 500 μl Astrozytenmedium in jeden einzelnen Einsatz. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C, 6 % Vol.-% CO2.
HINWEIS: Nach 42 - 72 h erreichen die Kulturen eine Konfluenz von ca. 100%. In diesem Stadium kann die Reinheit der Kultur durch Immunzytochemie überprüft werden. Die konfluenten Kulturen können bis zu 7 Tage lang aufbewahrt werden, bis zum nächsten Schritt übergegangen wird. Wechseln Sie alle 3 Tage die Hälfte des Mediums.
>3. Präparation primärer Hippocampus-Neuronen
HINWEIS: Primäre Hippocampus-Neuronen der Maus sollten von E15.5 - E16 Embryonen von zeitlich trächtigen Mäusen stammen.
- Bereiten Sie das Neuronenmedium (MEM mit 10 mM Natriumpyruvat, 0,1 % w/v Ovalbumin, 2 % v/v B27-Mediumzusatz und 0,1 % v/v Gentamicin (steril filtriert)) und das Präparationsmedium (HBSS mit 0,6 % w/v Glucose und 10 mM HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-Ethansulfonsäure)) vor. Das Neuronenmedium wird in Filterkolben bei 37 °C, 6 % v/v CO2 vorgewärmt und voräquilibriert.
- Legen Sie die Glasdeckgläser (12 mm Durchmesser) in die Vertiefungen der 24-Well-Platten (verwenden Sie die speziellen Deckgläser, die für die Verwendung mit Zellkultureinsätzen eingekerbt sind).
- Mindestens 1 h mit 15 μg/mL Poly-DL-Ornithin in Wasser (Zellkulturqualität) bei 37 °C bestreichen. Mindestens 500 μL pro Vertiefung verwenden, um sicherzustellen, dass die Deckgläser vollständig bedeckt sind. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS. Lassen Sie das PBS in den Vertiefungen, bis die Zellen plattiert sind. Achten Sie darauf, dass die Vertiefungen nicht austrocknen.
- Um die Hippocampi zu zerlegen, 3x 10 cm Schalen mit Zubereitungsmedium und 1x 2 mL Röhrchen mit 1 mL Zubereitungsmedium zubereiten. Bereiten Sie eine Schere und 2 feine Pinzetten vor.
- Opfern Sie die trächtige Maus durch Gebärmutterhalsluxation, sterilisieren Sie den Bauch, indem Sie ihn mit 70 % v/v Ethanol waschen, und öffnen Sie den Bauch mit einer scharfen Schere. Den geküstelten Uterus vorsichtig mit einer Schere herausschneiden und das Organ in eine 1x 10 cm große Schale mit Präparationsmedium füllen.
- Als nächstes entnehmen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter. Schneiden Sie vorsichtig in die Gebärmutter ein und entfernen Sie das Amnion, ohne die Embryonen zu beschädigen, indem Sie 2 Pinzetten verwenden. Danach enthaupten Sie jeden Embryo mit einer Schere und geben die Köpfe in eine zweite 10 cm große Schale, die mit Vorbereitungsmedium geliefert wird.
- Fahren Sie mit der Vorbereitung der Köpfe fort (ähnlich der in 1.4 - 1.7 beschriebenen Vorbereitung).
- Den Kopf mit einer Pinzette ruhigstellen und den Schädel und die Haut im Halsbereich in der Nähe des Hinterhirns, senkrecht zur Neuraxis, einschneiden. Verwenden Sie eine zweite Pinzette, um sowohl den Schädel als auch die bedeckende Haut anzuheben, und biegen Sie die weiche Schädelkappe in Richtung des rostralen Endes des Kopfes, wodurch das Gehirn freigelegt wird.
- Mit Hilfe von 2 Pinzetten lösen Sie das Gehirn von der Schädelhöhle. Schließen Sie dazu 1 Pinzette und trennen Sie das Gehirn vom Schädel, beginnend bei den Riechkolben und in Richtung Hinterhirn. Sammeln Sie das Gehirn in einer weiteren 10 cm großen Schale, die mit Zubereitungsmedium gefüllt ist.
- Präparieren Sie die Hippocampi aus den Kortex-Einheiten, wie oben für die Astrozytenpräparation beschrieben (Schritt 1.6). Entnehmen Sie die Hippocampi von jeder Hemisphäre und sammeln Sie sie in dem mit Präparationsmedium gefüllten 2-ml-Röhrchen.
- Nach Abschluss der Dissektion wird der Schlauch in die sterile Laminar-Flow-Bank überführt und das Hippocampusgewebe mit 1 ml Verdauungslösung, die Papain enthält, verdaut. Bereiten Sie die Aufschlusslösung wie in Schritt 1.9 - 1.10 beschrieben vor, verwenden Sie jedoch MEM anstelle von DMEM.
HINWEIS: Die Schritte 3.9 - 3.12 sind kritisch und sollten innerhalb von 10 - 15 Minuten abgeschlossen sein.
- Nach Beendigung des Aufschlusses wird die Aufschlusslösung vorsichtig durch leichtes Ansaugen mit einer Pipette entnommen.
- Waschen Sie die Hippocampi 3 Mal mit Neuronenmedium, indem Sie nacheinander 1 ml frisches Kulturmedium pro Waschgang hinzufügen und anschließend vorsichtig aspirieren. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension nicht.
- Nach dem letzten Waschschritt zerkleinern Sie das Gewebe vorsichtig in 1 ml Neuronenmedium.
- Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und einer Platte von 35.000 Zellen in 500 μl Neuronenmedium pro einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Platte (die in 3.2 erwähnte Platte).
HINWEIS: Optional kann ein Zellaliquot mit Trypanblau gegengefärbt werden, um die Vitalität der Zellpräparation zu beurteilen. Kontrollieren Sie die Beschichtungsdichte durch visuelle Inspektion mit dem Mikroskop (typischerweise 90 - 110 Zellen pro Gesichtsfeld eines Standard-10X-Objektivs).
- Die Neuronen werden 1 h lang bei 37 °C, 6 % v/v CO2 in den Inkubator gelegt.
- Nach der Inkubation nehmen Sie die vorbereiteten Inserts (besiedelt mit konfluenten Astrozyten-Monoschichten) aus dem Inkubator (siehe Schritt 2.8). Tauschen Sie das Medium aus, indem Sie das Astrozytenmedium aspirieren und durch 500 μl frisches Neuronenmedium ersetzen.
HINWEIS: Die Inserts sollten konfluente Astrozyten-Monoschichten nach 2 - 3 DIV (Days In Vitro) enthalten.
- Legen Sie die Einsätze mit den Astrozyten vorsichtig mit einer sterilen Pinzette in die Vertiefungen, die die Neuronenkulturen enthalten (Schritt 3.13).
- Die resultierende indirekte Neuron-Astrozyten-Co-Kultur wird bei 37 °C, 6 % v/v CO2,
wieder in den Inkubator eingesetzt
HINWEIS: Unter diesen Bedingungen können Neuronen bis zu 4 Wochen lang in einem vollständig definierten Medium kultiviert werden. Es ist kein Mediumwechsel notwendig. Bei Langzeitkulturen empfiehlt es sich, leere Vertiefungen mit sterilem Wasser zu füllen, um die Verdunstung aus der 24-Well-Platte zu reduzieren.
