Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Dissektion des Gehirns von Ratten oder Mäusen
HINWEIS: Sowohl Mäuse als auch Ratten können verwendet werden. Tiere, die älter als P8 sind, können ebenfalls verwendet werden (wir haben bis P12 getestet), aber die Entfernung der Hirnhäute wird immer schwieriger. Darüber hinaus nehmen die Zellausbeute und die Gesundheit ab, da Gehirnzellen älterer Tiere komplizierte Prozesse und Verbindungen gebildet haben, die während der Dissoziation des Gewebes brechen können, was zu einem erhöhten Zelltod führt. Kortikale Präparate werden hier beschrieben, aber auch andere Hirnregionen können verwendet werden.
- 0,05 % Trypsin-EDTA in ein 37 °C warmes Wasserbad geben.
- Euthanasieren Sie Tiere (trächtige Ratten für E19-Welpen oder P0-P8-Tiere), indem Sie die CO2 -Konzentration langsam erhöhen und das Gehirn isolieren. Die folgenden Schritte erfordern eine sterile Technik.
- Wenn Sie mit embryonalem Gewebe arbeiten, entfernen Sie zuerst die Embryonen aus der Gebärmutter und öffnen Sie die Embryonalsäcke, dann schneiden Sie sofort die Köpfe mit einer Schere ab. Wenn alle Köpfe abgeschnitten sind, werden sie in ein vorgekühltes Präpariermedium überführt.
- Sobald die Köpfe in das Medium getaucht sind, öffnen Sie die Haut und den Schädel (beide sind bei Jungtieren sehr weich) mit einer Pinzette und kneifen Sie das Kleinhirn ab. Hebeln Sie den Rest des Gehirns vorsichtig nach oben und aus dem Schädel heraus.
Anmerkung: Zwei bis vier E19-Embryonen liefern genug Gewebe für mindestens acht 10 cm große Schalen kortikaler Astrozyten, die am Tag der Sektion mit 500.000 Zellen pro Schale plattiert sind.
- Bei Neugeborenen oder älteren Welpen schneiden Sie die Köpfe mit einer Schere ab und isolieren Sie das Gehirn, indem Sie die Haut medial in einer geraden Linie vom Hinterkopf bis zur Nasenspitze durchschneiden. Ziehe die Haut zur Seite und schneide den Schädel vorsichtig links und rechts ab, dann hebe den Schädelknochen nach oben. Schneiden Sie das Kleinhirn ab und hebeln Sie den Rest des Gehirns nach oben und aus dem Schädel heraus.
Anmerkung: Zwei bis drei P0-P8-Jungtiere liefern genug Gewebe für mindestens acht 10-cm-Schalen kortikaler Astrozyten, die am Tag der Sektion mit 500.000 Zellen pro Schale beschichtet sind.
- Trennen Sie den Kortex von der darunterliegenden Mittelhirnstruktur. Platzieren Sie die Pinzette in der Längsspalte zwischen den Hemisphären und bewegen Sie dann die Pinzette zwischen den Kortex- und Mittelhirnstrukturen einer Hemisphäre (senkrecht zur Längsfissur), um jede Hemisphäre freizudrücken.
- Entferne mit der Pinzette alle Hirnhäute von jeder Hemisphäre (und ihrem Hippocampus) und trenne dann die Hippocampus. Wenn hippokampale Astrozyten benötigt werden, bringen Sie jeden Hippocampus in ein 15-ml-Röhrchen, das mit 14-ml-Dissektionsmedium auf Eis gefüllt ist.
- Entfernen Sie weitere Bereiche aus dem Kortex jeder Hemisphäre, wenn bestimmte Regionen benötigt werden (z. B. frontaler Kortex). Schneiden Sie jegliches kortikale Gewebe, das zur Erzeugung von Astrozyten verwendet werden soll, in Stücke, die nicht größer als 1 mm3 sind. Sammeln Sie alle kortikalen Gewebestücke in einem separaten 15-ml-Röhrchen, das mit einem Dissektionsmedium auf Eis gefüllt ist.
>2. Verdauung und Dissoziation des Gewebes
- Sobald alle Gewebestücke gesammelt sind, warten Sie, bis sie sich am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, und saugen Sie dann so viel Medium wie möglich ab.
- Fügen Sie 2-3 mL 0,05% Trypsin-EDTA mit einer serologischen Pipette hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen in einem 37 °C heißen Wasserbad für 20 min.
Anmerkung: Lösen Sie schnell sämtliches Trypsin-EDTA aus der Pipette, um die Gewebestücke zu vermischen und wieder absetzen zu lassen.
- Aspirieren Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig und lassen Sie Gewebestücke in so wenig Flüssigkeit wie möglich am Boden des Röhrchens.
- Fügen Sie 5 ml vorgekühltes Dissektionsmedium hinzu, um das restliche Trypsin-EDTA abzuwaschen. Pipettieren Sie an die Seite des oberen Teils des Röhrchens, um eine Durchmischung der Gewebestücke zu erreichen.
- Aspirieren Sie das Präpariermedium und lassen Sie die Gewebestücke in so wenig Flüssigkeit wie möglich. Wiederholen Sie diesen Waschschritt mit vorgekühltem Präpariermedium noch zweimal.
- Nach dem letzten Waschschritt fügen Sie 1 ml DMEM+ (auf Raumtemperatur erwärmt) mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze hinzu und zerkleinern Sie das Gewebe, indem Sie auf und ab pipettieren, ohne Blasen zu bilden.
Anmerkung: Es ist wichtig, die Bildung von Blasen zu vermeiden, da dies den pH-Wert der Lösung verändern kann, auf die Astrozyten sehr empfindlich reagieren.
- Setzen Sie ein 100-μm-Zellsieb in die Öffnung eines 50-ml-Röhrchens ein und befeuchten Sie den Filter mit 4,5 mL vorgekühltem DMEM+.
- Pipettieren Sie den 1 ml dissoziierte Gewebesuspension auf das Zellsieb und fügen Sie weitere 4,5 ml vorgekühltes DMEM+ hinzu, um die Zellen durch das Zellsieb zu spülen.
>3. Passierende Zellen
- Beschichten Sie die Zellkulturplatten am Tag vor der Passage mit 0,04 % PEI.
- Am Tag in vitro (DIV) 7 nach der Dissektion stellen Sie die 10-cm-Schalen mit Zellen in DMEM+ auf einen Laborschüttler im Inkubator und schütteln Sie die Schalen bei 110 U/min für 6 h.
- Waschen Sie das PEI von beschichteten Deckgläsern zweimal mit entionisiertem, destilliertem Wasser ab. Geben Sie NB+H-Medium in die Platten (500 μl pro Vertiefung für 24-Well-Platten und 2 mL pro Vertiefung für 6-Well-Platten). Die Platten im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 voräquilibrieren, während die 10-cm-Schalen geschüttelt werden, oder mindestens 30 Minuten lang.
- 20-30 min vor Ende des 6-stündigen Schüttelns 1x PBS, DMEM+, NB+H und 0,25% Trypsin-EDTA auf 37 °C im Wasserbad vorwärmen.
- Nehmen Sie nach 6 Stunden Schütteln die Kulturschalen vom Shaker und ersetzen Sie sofort das Medium (das abgeschüttelte Neuronen, Oligodendrozyten und Mikroglia enthält) durch 10 mL vorgewärmtes 1x PBS pro Schale.
Anmerkung: Es ist wichtig, das alte Medium, das abgelöste Zellen enthält, sofort zu aspirieren, um zu verhindern, dass sich die nicht-astrozytären Zellen erneut anheften.
- Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 3 ml vorgewärmtes Trypsin-EDTA pro Gericht hinzu. Inkubieren Sie jede Schale 4 Minuten lang im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2
- Geben Sie 5 ml vorgewärmtes DMEM+ zu den 3 ml Trypsin-EDTA in jeder Schale, pipettieren Sie die Zellen mit einer serologischen 5-ml-Pipette aus der Schale und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Pipettieren Sie direkt vom Boden der Schale - der Boden der Schale sollte klarer werden, wenn sich die Zellen lösen. Verwenden Sie nur serumhaltiges Medium (anstelle von DMEM+), da das Serum Trypsin inaktiviert.
- Die Zellsuspension bei 3.220 x g bei 20 °C 4 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL vorgewärmtem NB+H.
>4. Zellbeschichtung für endgültige Astrozytenkulturen
- Zählen Sie die Zellen.
- Platten 20.000 Zellen pro Well in 6-Well-Platten (in 2 mL NB+H Medium pro Well) oder 5.000 Zellen pro Well in 24-Well-Platten (in 500 μl NB+H Medium pro Well).
- Bewahren Sie die Zellkulturen bis zur weiteren Behandlung oder Analyse bei 37 °C und 5 % CO2 im Inkubator auf.
