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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Differenzierung von rtTA/Ngn2-positiven hiPSCs zu Neuronen auf 6-Well-MEAs und Glasdeckgläsern
HINWEIS: In diesem Protokoll werden die Details für die Unterscheidung von rtTA/Ngn2-positiven hiPSCs auf zwei verschiedenen Substraten bereitgestellt, d.h. 6-Well-MEAs (Geräte, die aus 6 unabhängigen Wells mit 9 aufgezeichneten und 1 eingebetteten Referenz-Mikroelektroden pro Well bestehen) und Glasdeckgläsern in den Wells einer 24-Well-Platte. Die Protokolle können jedoch leicht für größere Substrate (z. B. für die Wells von 12- oder 6-Well-Platten) angepasst werden, indem die genannten Werte entsprechend der Oberfläche hochskaliert werden.
- Bereiten Sie die MEAs oder Glasdeckgläser vor (Tag 0 und Tag 1)
- Am Tag vor Beginn der Differenzierung sterilisieren Sie die MEAs gemäß der Empfehlung des Herstellers.
- Verdünnen Sie das Adhäsionsprotein Poly-L-Ornithin (PLO) in sterilem Reinstwasser auf eine Endkonzentration von 50 μg/ml. Beschichten Sie den aktiven Elektrodenbereich von 6-Well-MEAs, indem Sie einen 100-μl-Tropfen des verdünnten PLO in jede Vertiefung geben. Legen Sie die Deckgläser mit einer sterilen Pinzette in die Vertiefungen der 24-Well-Platte. Geben Sie 800 μl des verdünnten PLO in jede Vertiefung. Verhindern Sie das Aufschwimmen der Deckgläser, indem Sie sie mit der 1000-μl-Pipettenspitze nach unten drücken.
- Inkubieren Sie die 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte O/N in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2. Am nächsten Tag aspirieren Sie das verdünnte PLO. Waschen Sie die Glasoberflächen der 6-Well-MEAs und die Deckgläser zweimal mit sterilem Reinstwasser.
- Verdünnen Sie das Laminin in kaltem DMEM/F12 auf eine Endkonzentration von 20 μg/ml (für die 6-Well-MEAs) und 10 μg/ml (für die Glasdeckgläser). Beschichten Sie sofort den aktiven Elektrodenbereich der 6-Well-MEAs, indem Sie einen Tropfen von 100 μl in jede Vertiefung geben. Geben Sie auf ähnliche Weise 400 μl des verdünnten Laminins in jede Vertiefung der 24-Well-Platte, um die Deckgläser zu beschichten. Verhindern Sie das Aufschwimmen der Deckgläser, indem Sie sie mit der 1.000-μl-Pipettenspitze nach unten drücken.
- Inkubieren Sie die 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2 für mindestens 2 h.
- Platten Sie die hiPSCs an (Tag 1)
HINWEIS: Bei den Volumina, die in den Schritten 3.2.1 bis 3.2.4 erwähnt werden, wird davon ausgegangen, dass die rtTA/Ngn2-positiven hiPSCs in einer 6-Well-Platte kultiviert werden und dass die Zellen einer Vertiefung geerntet werden. Die Volumina, die für die Beschichtung der Zellen auf den 6-Well-MEAs und/oder den Deckgläsern erforderlich sind, hängen von der Anzahl der 6-Well-MEAs und/oder der Anzahl der Deckgläser ab, die im Experiment verwendet werden. Die in den Schritten 3.2.6 - 3.2.8 angegebenen Zahlen ermöglichen eine Skalierung auf unterschiedliche Versuchsgrößen.
- DMEM/F12-, CDS- und E8-Medium mit 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin auf R/T erwärmen. Doxycyclin bis zu einer Endkonzentration von 4 μg/ml und ROCK-Inhibitor auf das E8-Medium geben.
- Aspirieren Sie das verbrauchte Medium der rtTA/Ngn2-positiven hiPS-Zellen und fügen Sie 1 mL CDS zu den hiPS-Zellen hinzu. 3 - 5 min in einem befeuchteten 37 °C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2 inkubieren. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen voneinander lösen.
- Geben Sie 2 mL DMEM/F12 in die Vertiefung, suspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer 1.000 μl Pipette und geben Sie die Zellen in ein 15 mL Röhrchen. Geben Sie 7 mL DMEM/F12 in die Zellsuspension. Die Zellen bei 200 x g 5 min drehen.
- Der Überstand wird aspiriert und 2 ml des vorbereiteten E8-Mediums zugegeben. Dissoziieren Sie die hiPSCs, indem Sie die Spitze einer 1.000-μl-Pipette an die Seite des 15-ml-Röhrchens legen und die Zellen vorsichtig resuspendieren. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen dissoziiert sind.
- Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen (Zellen/ml) mit einer Hämozytometerkammer.
Anmerkung: Ein 6-Well-Platten-Well mit 80 - 90 % Konfluenz ergibt in der Regel insgesamt 3,0 - 4,0 x 106 Zellen.
- Aspirieren Sie das verdünnte Laminin. Für die 6-Well-MEAs verdünnen Sie die Zellen, um eine Zellsuspension von 7,5 x 105 Zellen/ml zu erhalten. Plattieren Sie die Zellen, indem Sie einen Tropfen von 100 μl der Zellsuspension auf den aktiven Elektrodenbereich in jeder Vertiefung der 6-Well-MEAs geben. Für die Deckgläser verdünnen Sie die Zellen, um eine Zellsuspension von 4,0 x 104 Zellen/ml zu erhalten. Plattieren Sie die Zellen, indem Sie 500 μl der Zellsuspension in die Vertiefungen der 24-Well-Platte geben.
Anmerkung: Die endgültige Zelldichte auf den MEAs ist höher als auf den Deckgläsern (Abbildung 1A und B). Wir fanden heraus, dass diese hohe Zelldichte erforderlich war, um die Netzwerkaktivität richtig aufzuzeichnen. Im Protokoll werden die Zahlen angegeben, die für die Assays optimal waren.
- Stellen Sie die 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte für 2 h (MEAs) oder O/N (24-Well-Platte) in einen befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2
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- Nach 2 Stunden geben Sie vorsichtig 500 μl des vorbereiteten E8-Mediums in jede Vertiefung der 6-Well-MEAs. Stellen Sie die 6-Well-MEAs O/N in einen befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2.
- Wechseln des Mediums (Tag 2)
- Bereiten Sie am nächsten Tag DMEM/F12 mit 1% (v/v) N-2-Supplement, 1% (v/v) nicht-essentiellen Aminosäuren und 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin vor. Geben Sie humanes rekombinantes Neurotrophin-3 (NT-3) in eine Endkonzentration von 10 ng/ml, humanen rekombinanten hirnabgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) in eine Endkonzentration von 10 ng/ml und Doxycyclin in eine Endkonzentration von 4 μg/ml. Das Medium auf 37 °C erwärmen.
- Geben Sie Laminin bis zu einer Endkonzentration von 0,2 μg/ml in das Medium. Filtern Sie das resultierende Medium. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der 6-Well-MEAs und der 24-Well-Platte und ersetzen Sie es durch das vorbereitete Medium. Inkubieren Sie die 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte O/N in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2.
- Fügen Sie Ratten-Astrozyten hinzu (Tag 3)
ANMERKUNG: Bei den in diesem Protokoll genannten Volumina wird davon ausgegangen, dass die Ratten-Astrozyten in T75-Kulturflaschen kultiviert werden. Es ist wichtig, dass die Ratten-Astrozyten, die den Kulturen zugesetzt werden, von guter Qualität sind. Wir verwenden zwei Kriterien, um zu überprüfen, ob die Ratten-Astrozyten von guter Qualität sind. Erstens sollte die Astrozytenkultur der Ratte in der Lage sein, innerhalb von zehn Tagen nach der Isolierung aus den embryonalen Gehirnen der Ratte konfluent zu wachsen. Zweitens sollten die Ratten-Astrozyten nach der Teilung der Ratten-Astrozytenkultur in der Lage sein, eine konfluente, tessellierte Monoschicht zu bilden (Abbildung 1C). Wenn die Astrozytenkultur der Ratte diese beiden Kriterien nicht erfüllt, raten wir davon ab, diese Kultur für Differenzierungsexperimente zu verwenden.
- 0,05 % Trypsin-EDTA auf RT erwärmen. DPBS und DMEM/F12 mit 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin auf 37 °C erwärmen.
- Aspirieren Sie das verbrauchte Medium der Astrozytenkultur der Ratte. Waschen Sie die Kultur, indem Sie 5 ml DPBS hinzufügen und schwenken Sie sie vorsichtig herum.
- Aspirieren Sie das DPBS und fügen Sie 5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu. Schwenken Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig herum. In einem befeuchteten 37 °C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2 für 5 - 10 min inkubieren.
- Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen abgelöst haben. Löse die letzten Zellen, indem du ein paar Mal auf den Kolben drückst.
- 5 ml DMEM/F12 werden in den Kolben gegeben. Zerreiben Sie die Zellen vorsichtig im Kolben mit einer 10-ml-Pipette. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen. Die Tube bei 200 x g für 8 min drehen.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM/F12. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen (Zellen/ml) mit einer Hämozytometerkammer.
- Fügen Sie 7,5 x 104 Astrozyten pro Vertiefung der 6-Well-MEAs hinzu. Fügen Sie 2,0 x 104 Astrozyten pro Vertiefung der 24-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die MEAs und die 24-Well-Platte O/N in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2.
- Wechseln des Mediums (Tag 4)
- Bereiten Sie das neurobasale Medium mit 2% (v/v) B-27-Supplement, 1% (v/v) L-Alanyl-L-Glutamin und 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin vor. Geben Sie NT-3 bis zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml, BDNF bis zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml und Doxycyclin bis zu einer Endkonzentration von 4 μg/ml. Zusätzlich wird Cytosin β-D-Arabinofuranosid in einer Konzentration von 2 μM.
HINWEIS: Cytosin β-D-Arabinofuranosid wird dem Medium zugesetzt, um die Astrozytenproliferation zu hemmen und die verbleibenden hiPSCs abzutöten, die sich nicht in Neuronen differenzieren.
- Das Medium filtrieren und auf 37 °C erwärmen. Das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der 6-Well-MEAs und der 24-Well-Platte aspirieren und durch das vorbereitete Medium ersetzen. Bewahren Sie die 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2 auf.
- Refresh the medium (Tag 6 - 28)
HINWEIS: Aktualisieren Sie ab Tag 6 alle zwei Tage die Hälfte des Mediums. Ab dem 10. Tag wird das Medium mit FBS ergänzt, um die Lebensfähigkeit der Astrozyten zu unterstützen.
- Bereiten Sie das neurobasale Medium mit 2% (v/v) B-27-Supplement, 1% (v/v) L-Alanyl-L-Glutamin und 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin vor. Geben Sie NT-3 bis zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml, BDNF bis zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml und Doxycyclin bis zu einer Endkonzentration von 4 μg/ml. Ab Tag 10 ergänzen Sie das Medium zusätzlich mit 2,5 % (v/v) FBS. Das entstandene Medium filtrieren und auf 37 °C erwärmen.
- Entfernen Sie die Hälfte des verbrauchten Mediums mit einer 1000-μl-Pipette aus den Vertiefungen der 6-Well-MEAs und der 24-Well-Platte und ersetzen Sie es durch das vorbereitete Medium. Bewahren Sie die 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2 auf.
