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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Präparation von Neuronenkugeln als hängende Tropfenkultur (Days in vitro (DIV) 0-3)
HINWEIS: Die hier beschriebenen Verfahren zur Vorbereitung von Neuronen-Ballkulturen basieren auf der zuvor von der Sasaki-Gruppe berichteten Methode, mit einigen Modifikationen. Wir haben auch mehrere Verfahren der Banker-Methode für dissoziierte Kultur übernommen.
- Bestätigen Sie Folgendes, bevor Sie mit der Dissektion beginnen
- Bereiten Sie alle erforderlichen Lösungen vor und sterilisieren Sie sie im Voraus durch Autoklav/Filtration.
- Halten Sie alle Instrumente und Materialien bereit, die bei jedem Schritt dieser kortikalen Neuronenkultur verwendet werden sollen.
- Besprühen und wischen Sie den Laminarluftschrank, den Seziertisch, die Tischplatte des Stereomikroskops, die Schere und die Pinzette mit 70% Ethanol ab.
- Euthanasieren Sie die Maus nach Anwendung von CO2 und präparieren Sie den Bauch, um E16-Embryonen zu erhalten.
- Entnehmen Sie die Gehirne vorsichtig mit Hilfe feiner Pinzettenspitzen aus den Embryonen und geben Sie sie in 60 mm Zellkulturschalen, die 4 ml 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure, HEPES Buffered Salt Solution (HBSS), enthalten.
Anmerkung: Das Dissektionsmedium HBSS enthält 10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM Natriumchlorid (NaCl), 5,4 mM Kaliumchlorid (KCl), 1,09 mM Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), 1,1 mM Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 5,6 mM D-Glucose und 5,64 μM Phenolrot.
- Entfernen Sie die Kopfhaut, schneiden Sie den Riechkolben ab, trennen Sie die Kortikalen mit den feinen Spitzen einer Pinzette unter einem Stereomikroskop von jeder Gehirnhälfte und geben Sie sie in eine weitere 60-mm-Schale mit frischem HBSS. Verwenden Sie mindestens 3-5 Embryonen für jede einzelne Neuronenkugelkultur.
- Schneiden Sie die Kortike mit einer Mikrodisparierfederschere in einer Laminar-Flow-Zellkulturhaube in kleine Stücke.
- Übertragen Sie die zerkleinerten Kortexe in ein 15-ml-Röhrchen und trypsinisieren Sie die zerkleinerten Kortexe in 4 mL mit 0,125 % Trypsin in HBSS für 4,5 min in einem Wasserbad bei 37 °C.
Anmerkung: Diese Trypsinisierungszeit ist entscheidend für eine effiziente Neuronenkultur, da die zunehmende Zeit (> 4,5 min) zu viel mehr toten Neuronen führt.
- Übertragen Sie die Zellaggregate mit einer sterilen Transferpipette in ein neues 15-ml-Röhrchen mit 10 mL HBSS und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei 37 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
- Übertragen Sie die Zellaggregate in ein neues 15-ml-Röhrchen mit 2 ml Neurobasalmedium, das GlutaMax, B27-Supplement (NGB-Medium), 0,01 % DNase I und 10 % Pferdeserum enthält.
- Zerreiben Sie die trypsinisierten Kortexe, indem Sie sie wiederholt auf und ab pipettieren (3-5 Mal) mit einer feuerpolierten Feinglas-Pasteurpipette.
Anmerkung: Der Durchmesser einer feuerpolierten Feinglas-Pasteurpipette ist sehr wichtig, wie in der Banker-Methode beschrieben. Wenn die Pipette zu schmal ist, um den Kortex zu passieren, bereiten Sie Pipetten mit 2-3 verschiedenen Größen vor und versuchen Sie es mit einer größeren Pipette.
- Zur Herstellung von Neuronenkugeln nehmen Sie die obige Zellsuspension und stellen Sie die Zelldichte mit einem NGB-Medium auf 1 x 106 Zellen/ml ein.
- Kultivieren Sie die kortikalen Neuronen als hängende Tropfen mit 10.000 Zellen/Tropfen (1 Tropfen entspricht 10 μl) in den oberen Lidern von 10 cm großen Kulturschalen.
- Geben Sie 7 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den unteren Teil der Kulturschalen und bewahren Sie sie dann 3 Tage lang in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 unter befeuchteten Bedingungen auf, um die Bildung von Neuronenkugeln zu ermöglichen.