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1. Kulturvorbereitung eines dissoziierten adulten Neurons des dorsalen Ganglions oder des DRG-Neurons
- Vor dem Einrichten der Kultur ist eine 6-Well-Platte mit Poly-D-Lysin und Laminin vorzubeschichten. Inkubieren Sie eine 6-Well-Platte mit 0,01 % Poly-D-Lysin bei 37 °C für 2 h oder bei 4 °C über Nacht. Waschen Sie dann den Teller zweimal mit destilliertem Wasser.
- Die Platte wird 2 h lang bei Raumtemperatur mit Lamininlösung in einer Konzentration von 3 μg/ml inkubiert und anschließend zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Trocknen Sie die Platte mindestens 1 h bei Raumtemperatur.
- Euthanasieren Sie eine Maus in einer transparenten CO2 -Kammer, die mit einer komprimierten CO2 -Gasflasche verbunden ist. Mit einer chirurgischen Klinge die Haut über der Wirbelsäule einschneiden und die paravertebrale Muskulatur beidseitig präparieren, um die Wirbelknochen freizulegen. Entfernen Sie die Wirbelknochen sorgfältig mit einem chirurgischen Rongeur mit schmaler Spitze, bis die DRGs vollständig freigelegt sind.
Anmerkung: Adulte DRG-Neuronen werden von adulten männlichen C57BL6-Mäusen im Alter zwischen 8 Wochen und 12 Wochen gewonnen.
- Entfernen Sie die DRGs bilateral von der S1 bis hinauf zur C1-Ebene mit einer Iridektomieschere und einer Pinzette mit feiner Spitze unter einem Präpariermikroskop. Versuchen Sie, die Wurzeln vollständig aus DRGs herauszuschneiden, um die Kontamination mit Schwann-Zellen oder Fibroblasten zu minimieren.
- Lagern Sie die präparierten DRGs in einer 60 mm Petrischale mit 5 mL kaltem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) auf Eis, bis alle DRGs der nächste Schritt sind, auch wenn noch DRGs gesammelt werden.
Anmerkung: Es ist wichtig, die DRGs so schnell wie möglich zu zerlegen. Die Entnahme aller DRGs aus einer Maus sollte nicht länger als 30 min dauern. 30 min nach der Euthanasie, beenden Sie die Entnahme der DRGs und fahren Sie mit dem Transfer der DRGs in ein 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen mit einer blauen Pipettenspitze (1000 μL) mit abgeschnittenem Ende fort. Entfernen Sie das DMEM nach einem kurzen Schleudern für einige Sekunden mit einer Minizentrifuge. Fügen Sie 1 ml DMEM mit 125 U/ml Typ-XI-Kollagenase hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen 90 Minuten lang mit einer sanften Drehung (35-40 U/min) mit einem Twister-Shaker in einem 37 °C-Inkubator. Fixieren Sie das Rohr mit dem Klebeband auf dem Boden des Schüttels.
- Verwerfen Sie kollagenasehaltiges DMEM und fügen Sie 1 ml frisches DMEM hinzu. Warten Sie, bis die schwimmenden DRGs vollständig auf den Boden gesunken sind, und entfernen Sie dann das DMEM mit den Geweberesten. Wiederholen Sie diesen Waschschritt mindestens sechsmal.
Anmerkung: Versuchen Sie nicht, den Überstand vollständig zu entsorgen. Achten Sie darauf, keine DRGs mit dem überstehenden DMEM zu entfernen.
- Übertragen Sie die DRGs mit einer blauen Pipettenspitze (1000 μl) mit abgeschnittenem Ende in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Pipettieren Sie dann mindestens 15 Mal vorsichtig mit einer blauen Spitze (1000 μl) auf und ab, um eine homogene Zellsuspension herzustellen. Vermeiden Sie Blasenbildung und versuchen Sie, den Boden des konischen Röhrchens nicht mit einer Pipettenspitze zu berühren.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 239 x g für 3 min und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit schwimmenden Ablagerungen. Fügen Sie 1 ml Neurobasalmedium hinzu, das mit B27 (2,0 % v/v) ergänzt ist, und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie es vorsichtig 5 bis 10 Mal auf und ab pipettieren.
- Die Zellsuspension wird durch ein 70-μm-Zellsieb geleitet, das auf einem konischen 50-ml-Röhrchen aufgesetzt ist. Warten Sie 2 Minuten und gießen Sie dann Neurobasal/B-27 Medium mit einer Pipettierhilfe auf das Sieb.
- Plattieren Sie alle gesammelten DRG-Neuronen (ca. 2 x 106 DRG-Neuronen von einer Maus) auf zwei Vertiefungen der 6-Well-Platte. DRG-Neuronen einer erwachsenen Maus bedecken zwei Vertiefungen in einer 6-Well-Platte. Stellen Sie die Platte dann in einen CO2 -Inkubator bei 37 °C, bis der Makrophagen co-kulturiert.
2. Co-Kultur von primären peritonealen Makrophagen auf einem Zellkultureinsatz
HINWEIS: Etablierung der Co-Kulturen 4 h nach der ersten Plattierung der dissoziierten DRG-Neuronen
- Primäre peritoneale Makrophagen werden von adulten männlichen C57BL6-Mäusen im Alter zwischen 8 Wochen und 12 Wochen hergestellt. Ein Tier in einer CO2-Kammer einschläfern. Schneiden Sie die Bauchhaut vorsichtig ein, legen Sie das Bauchfell frei und vermeiden Sie es, das Bauchfell zu schneiden, um ein Austreten von Spülflüssigkeit zu verhindern.
- Punktieren Sie das Peritoneum mit einer Spritze mit einer 22G-Nadel und injizieren Sie 10 ml eiskalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Bauchhöhle. Massieren Sie das Bauchfell sanft für 1-2 min. Ziehen Sie dann die Nadel heraus und drücken Sie das PBS durch die Nadelpunktionsstelle heraus und sammeln Sie die Spülflüssigkeit in einem konischen 50-ml-Schlauch.
Anmerkung: Legen Sie die Spritze vor dem Gebrauch auf Eis, um die Kälte des PBS zu erhalten.
- Die Spülflüssigkeit wird bei 239 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um die zellulären Bestandteile zu pelletieren. Resuspendieren Sie das Pellet mit 3 mL des Lysepuffers für rote Blutkörperchen (RBC) für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension erneut bei 239 x g für 10 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie das Pellet mit 3 mL PBS und zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut, um den restlichen Erythrozyten-Lysepuffer zu entfernen.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass der Erythrozyten-Lysepuffer vollständig entfernt wurde. Andernfalls kann der verbleibende Erythrozyten-Lysepuffer für die kultivierten Makrophagen toxisch sein.
- Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 1 ml Neurobasal/B-27-Medium. Die Hälfte aller gesammelten Makrophagen (insgesamt 3 × 106 bis 6 x 106 Zellen) wird auf einen Zellkultureinsatz mit einer effektiven Fläche von 4,2 cm2 aufgesetzt, der auf die Vertiefung aus dissoziiertem DRG aufgesetzt wird.
Anmerkung: Während der Co-Kultur-Periode werden Makrophagen im Neurobasal/B-27-Neuronenkulturmedium gezüchtet. Ein adäquates Überleben der Makrophagen unter dieser Bedingung wurde bestätigt.
3. Behandlung von db-cAMP (dibutyrylzyklisches AMP) und Entnahme von Makrophagen CM
HINWEIS: Beginnen Sie die Behandlung mit db-cAMP 4 Stunden nach den Neuron-Makrophagen-Cokulturen.
- Geben Sie 2 μl 100 μM db-cAMP-Lösung in die Neuron-Makrophagen-Cokulturen. Fügen Sie das gleiche Volumen PBS für ein Kontrollexperiment hinzu.
- Füllen Sie nach 24 Stunden eine leere Vertiefung mit 1 ml Makrophagen-Kulturmedium in derselben 6-Well-Platte. Übertragen Sie den Zellkultureinsatz in den Neuron-Makrophagen-Cokulturen mit einem Makrophagen-Kulturmedium in die leere Vertiefung. Halten Sie die Zellen 72 Stunden lang unter dem gleichen Zustand, ohne das Medium zu wechseln.
Anmerkung: Wir fügen während der CM-Entnahme nur 1 ml Makrophagen-Kulturmedium hinzu, um konzentriertes CM herzustellen. Während der CM-Entnahme haben wir bei Bedarf mehr hinzugefügt, um die Makrophagen innerhalb des Einsatzes vollständig abzudecken.
- Nach 72 h zentrifugieren Sie den Makrophagen CM bei 239 x g für 5 min, um die zellulären Bestandteile zu entfernen. Den Überstand durch einen 0,2-μm-Filter leiten, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. Lagern Sie das gesammelte CM bis zur Verwendung bei -70 °C.