Methodenartikel

Verwendung eines Makrophagen-konditionierten Mediums zur Förderung von Neuronenerweiterungen

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Yun, H. J., et al. Neuron-Makrophagen-Co-Kulturen zur Aktivierung von Makrophagen, die molekulare Faktoren mit Neuritenwachstumsaktivität sezernieren. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt einen Assay zur Förderung des Wachstums von Neuronenprojektionen, bekannt als Neuritenwachstum, unter Verwendung des Makrophagen-konditionierten Mediums. Co-Kultur von Neuronen und Makrophagen mit cAMP und Ernte des von Makrophagen abgeleiteten konditionierten Mediums. Das Wachstum der Neuronen mit dem konditionierten Medium fördert das Auswachsen von Neuriten. Diese Auswüchse werden fluoreszenzmarkiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.

Protokoll

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>1. Behandlung von Db-Camp und Sammlung von Makrophagen-konditioniertem Medium

HINWEIS: Beginnen Sie die db-cAMP-Behandlung 4 Stunden nach den Neuron-Makrophagen-Co-Kulturen.

  1. Geben Sie 2 μl 100 μM Dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) Lösung in die Neuron-Makrophagen-Cokulturen. Fügen Sie das gleiche Volumen phosphatgepuffertes Salin (PBS) für ein Kontrollexperiment hinzu.
  2. Füllen Sie nach 24 Stunden eine leere Vertiefung mit 1 ml Makrophagen-Kulturmedium in derselben 6-Well-Platte. Übertragen Sie den Zellkultureinsatz in den Neuron-Makrophagen-Cokulturen in die leere Vertiefung mit Makrophagen-Kulturmedium. Halten Sie die Zellen 72 Stunden lang unter dem gleichen Zustand, ohne das Medium zu wechseln.
    Anmerkung: Wir fügen nur 1 ml Makrophagen-Kulturmedium während der Entnahme von konditioniertem Medium (CM) hinzu, um konzentriertes CM herzustellen. Während der CM-Entnahme haben wir bei Bedarf mehr hinzugefügt, um die Makrophagen innerhalb des Einsatzes vollständig abzudecken.
  3. Nach 72 h zentrifugieren Sie den Makrophagen CM bei 239 x g für 5 min, um die zellulären Bestandteile zu entfernen. Den Überstand durch einen 0,2-μm-Filter leiten, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. Lagern Sie das gesammelte CM bis zur Verwendung bei -70 °C.

>2. Neuriten-Auswuchs-Assay mit gesammeltem CM

  1. Bevor Sie eine separate DRG-Neuronenkultur für Erwachsene einrichten, beschichten Sie einen 8-Well-Objektträger mit Poly-D-Lysin und Laminin. Inkubieren Sie eine 6-Well-Platte mit 0,01 % Poly-D-Lysin bei 37 °C für 2 h oder bei 4 °C über Nacht. Waschen Sie dann den Teller zweimal mit destilliertem Wasser.
  2. Die Platte wird 2 h lang bei Raumtemperatur mit Lamininlösung in einer Konzentration von 3 μg/ml inkubiert und anschließend zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Trocknen Sie die Platte bei Raumtemperatur mindestens 1 h lang.
  3. Erhalten Sie dissoziierte adulte DRG-Neuronen in neurobasalem Medium, das mit B27 ergänzt ist. Platte 5 x 104 Zellen pro Well auf den vorbeschichteten 8-Well-Kammerobjektträger.
  4. Stellen Sie den Objektträger für 2 h in einen 37 °C heißen Inkubator, damit die Zellen am Boden befestigt werden können. Ersetzen Sie dann das Kulturmedium durch das aufgetaute CM, das auf 37 °C vorgewärmt wird.
    Anmerkung: Achten Sie darauf, den Boden des 8-Well-Kammerobjektträgers nicht zu berühren, wenn Sie das Kulturmedium entfernen und das gesammelte CM hinzufügen.
  5. 15 h nach dem ersten Plattieren das Medium entfernen und die Zellen einmal mit PBS waschen. Geben Sie dann 200 μl eiskalte 4%ige Paraformaldehydlösung in die Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang mit der Paraformaldehydlösung bei 4 °C
    Anmerkung: Die DRG-Neuronenkultur für den Neuriten-Outgrowth-Assay sollte genau auf 15 h begrenzt werden. Unter dieser Bedingung gibt es keinen nennenswerten Neuritenauswuchs.
  6. Dreimal mit eiskaltem PBS waschen und dann 30 Minuten lang mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) und 0,1 % Triton-X blockieren. Inkubieren Sie die fixierten Zellen mit einer mit 10 % NGS verdünnten Primärantikörperlösung (Anti-Tuj-1) für 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
  7. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und inkubieren Sie die Zellen dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Sekundärantikörperlösung (Ziegen-Anti-Maus). Waschen Sie dann zweimal mit PBS und befestigen Sie den Kulturobjektträger mit einem Deckglas (24 × 50 mm) mit einer Eindecklösung.
  8. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, um das Wachstum von Neuriten sichtbar zu machen (Abbildung 1).

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse des Neuriten-Outgrowth-Assays unter Verwendung eines konditionierten Mediums, das unter verschiedenen Bedingungen erhalten wurde. (A, B) Adulte DRG-Neuronen wurden akut dissoziiert und genau 15 h lang kultiviert. 2 h nach der Beschichtung wurde das Kulturmedium durch konditioniertes Medium (CM) ersetzt, das aus Neuron-Makrophagen-Cokulturen gewonnen wurde, di...

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellkultureinsatz, transparente PET-Membran, 0,4 μm PorengrößeCorning, FalkeArtikel-Nr.: 353090Transparente PET-Membran mit 0,4 μm Porengröße für 6-Well-Platten
70-μm Nylon-ZellsiebCorning, FalkeArtikel-Nr.: 352350
8-Well-Kultur-SlideBiocoat354632mit einer gleichmäßigen Applikation von Poly-D-Lysin
Neurobasales MediumThermo Fisher Scientific, GibcoArtikel-Nr.: 21103-049Enthält 1 % Glutamax und 1 % Penicilin-Streptomycin
B-27 Ergänzung, serumfreiThermo Fisher Scientific, GibcoArtikel-Nr.: 17504-044extrazelluläre Lösung
GlutamaxThermo Fisher Scientific, GibcoArtikel-Nr.: 35050-061
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific, GibcoNr. 15140-122
Poly-D-Lysin-HydrobromidSigma-AldrichNr. P6407-5MG
LamininThermo Fisher Scientific, InvitrogenArtikel-Nr.: 23017-015
Adenosin 3', 5'-cyclisches Monophosphat, N6,O2'-dibutyryl-, NatriumsalzMerck Millipore Corporation, CalbiochemArtikel-Nr.: 28745
10% normales ZiegenserumThermo Fisher Scientific16210072
Triton-X-100Daejung Chemie- und Metall CoArtikel-Nr.: 8566-4405
Anti β III Tubulin (Tuj-1)Promega CorporationNr. G7121Monoklonaler Maus-Antikörper
Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (H+L)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenNr. A11005
HämazytometerMarienfeld-SuperiorN/A
CO2-Inkubator für ZellkulturenPanasonicN/A
TischzentrifugeSorvallN/A
Konfokales MikroskopOlympus Amerika IncIX71
FBS (Fötales Rinderserum)VWR International, HycloneSH30919.03
GmbH

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Schlagwörter

Neurite OutgrowthNeuron Macrophage Co culturecAMP TreatmentFluorescence MicroscopyCentrifugation ProtocolParaformaldehyde FixationPrimary AntibodiesSecondary AntibodiesPoly D lysine Coating

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