Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Mikrofluidische Kammer oder MFC-Vorbereitung
- PDMS-Gießen in Primärformen (Abbildung 1)
- Kaufen oder erstellen Sie Primärformen (Wafer) nach einem detaillierten Protokoll.
- Verwenden Sie Druckluft, um jegliche Art von Schmutz von der Wafer-Plattform zu entfernen, bevor Sie mit dem Beschichtungsschritt fortfahren. Die Oberfläche der Wafer sollte glatt und klar aussehen.
- Füllen Sie einen Behälter mit 50 mL flüssigem Stickstoff. Bereiten Sie eine 10-ml-Spritze und eine 23-g-Nadel vor.
Anmerkung: Alle Eingriffe ab diesem Schritt müssen in einer chemischen Haube durchgeführt werden.
- Verwenden Sie die Spritze und die Nadel in der Chemikalienhaube, um 2 ml flüssigen Stickstoff zu sammeln. Auch wenn es den Anschein hat, als wäre die Luft angesaugt worden, ist die Spritze mit Stickstoff gefüllt (Abbildung 1A). Legen Sie die waferhaltige Platte in einen verschließbaren Behälter.
- Schrauben Sie eine Chlortrimethylsilanflasche auf, stechen Sie die Gummikappe mit der stickstoffgefüllten Spritze ein und injizieren Sie den gesamten Inhalt der Spritze in die Flasche. Ohne die Nadel herauszuziehen, die Flasche auf den Kopf stellen und 2 ml Chlortrimethylsilan zurückziehen.
Anmerkung: Aufgrund des Spritzendrucks wird eine kleine Menge Chlortrimethylsilan aus der Nadel gesprüht. Um eine Gefahr zu vermeiden, richten Sie die Nadel auf die Innenwand der Haube (Abbildung 1B).
- Chlortrimethylsilan gleichmäßig im Behälter verteilen (aus Schritt 1.1.4), jedoch nicht direkt auf dem Wafer oder der waferhaltigen Platte. Verschließen Sie den Behälter und inkubieren Sie ihn 5 Minuten pro Wafer.
Anmerkung: Wenn der Wafer zum ersten Mal mit Chlortrimethylsilan beschichtet wird, sollte für jeden Wafer eine Inkubationszeit von 1 h vorgesehen werden.
- Nehmen Sie die Wafer und den Behälter nicht für 30 min.
aus der Chemikalienhaube
Vorsicht: Chlortrimethylsilan ist leicht flüchtig.
- Wiegen Sie die PDMS-Base (siehe Materialtabelle) in einem 50-ml-Röhrchen und fügen Sie das PDMS-Härter im Verhältnis 16:1 hinzu (z. B. 47,05 g Base und 2,95 g Härter). 10 Minuten lang mit einem Rotator mit niedriger Geschwindigkeit mischen.
- Gießen Sie PDMS in die gewünschte Höhe in jede waferhaltige Platte (Abbildung 1C).
Anmerkung: Die Verwendung dünner mikrofluidischer Kammern (bis zu 3-4 mm) verbessert die Haftung an der Kulturschale und verhindert Leckagen.
- Legen Sie alle Platten zusammen für 2 Stunden in einen Vakuumexsikkator (Abbildung 1E). Dieser Prozess entfernt die im PDMS eingeschlossene Luft, wodurch Luftblasen beseitigt werden und eine klare, gleichmäßige Form gebildet wird.
- Die Platten für 3 h (oder über Nacht) bei 70 °C in den Ofen stellen (Abbildung 1E).
Anmerkung: Die Platten sollten waagerecht sein, wenn sie in den Ofen gestellt werden.
- PDMS-Gießen in Epoxidformen
Anmerkung: Da die Wafervorbereitung teuer ist, spezielle Geräte erfordert und die zerbrechlichen Wafer beschädigen kann, ist es möglich, Epoxidrepliken von Wafern zu erzeugen. Die Repliken sind billiger, langlebiger und können für die Massenproduktion von mikrofluidischen Kammern verwendet werden.
- Gießen und härten Sie PDMS (wie in 1.1.8-1.1.11 beschrieben) in den ursprünglichen Wafer ein.
- Entfernen und trennen Sie überschüssige Teile des PDMS, so dass nur die mikrofluidischen Elemente und der Funktionsbereich übrig bleiben, der für die Verarbeitung zu mikrofluidischen Kammern erforderlich ist.
- Wickeln Sie das PDMS sofort mit dickem, klebrigem Klebeband ein, um zu verhindern, dass sich Staub ansammelt.
- Wählen Sie eine Kunststoffschale in Gewebekulturqualität, in die das gesamte PDMS passt, und lassen Sie Platz für Epoxidharz. Der Abstand vom PDMS zur Kunststoffschale sollte weniger als 5 mm betragen.
- Bereiten Sie eine kleine Menge PDMS im Verhältnis 10:1 gemischt vor (Basis: Härter). Das frische flüssige PDMS wird verwendet, um das feste PDMS auf den Boden der Kunststoffplatte zu kleben.
- Tragen Sie eine minimale Menge des flüssigen PDMS auf den mittleren Boden der Kunststoffplatte auf und entfernen Sie dann das Klebeband vom PDMS und kleben Sie es auf den Boden der Kunststoffschüssel. Achten Sie darauf, dass die mikrofluidischen Elemente nach oben zeigen.
- Lassen Sie das PDMS 30 min in einem 70 °C heißen Backofen aushärten.
- Bereiten Sie das Epoxidharz vor, indem Sie die Basis und das Härter im Verhältnis 100:45 jeweils in einem Reagenzglas mischen. Unterschiedliche Epoxidharze können unterschiedliche Mischungsverhältnisse aufweisen. Das erforderliche Volumen für eine reguläre 100-mm-Platte beträgt ca. 40 ml.
- Lassen Sie das Epoxidharz 10 Minuten lang in einem Rotator gut mischen, bis die Mischung sichtbar homogen wird (d. h. es gibt keine sichtbaren faserartigen Artefakte in der Flüssigkeit).
- Zentrifugieren Sie die Epoxidmischung bei 400 x g für 5 Minuten, um die darin eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.
- Verteilen Sie während der Zentrifugation eine dünne Schicht Silikonfett um die Wände und alle anderen freiliegenden Kunststoffteile der Kulturschale. Dadurch wird verhindert, dass das Epoxidharz mit dem Schalenkunststoff polymerisiert, und das ausgehärtete Epoxidharz kann am Ende des Protokolls leicht entfernt werden.
- Gießen Sie das Epoxidharz langsam in die Schale, bis es das PDMS vollständig bedeckt und mindestens 5 mm darüber hinausgeht. Verhindern Sie die Bildung von Blasen im Epoxidharz, indem Sie keinen Abstand zwischen dem Rohr und der Platte einhalten. Stellen Sie die Platte an einen sicheren Ort, damit sie in den nächsten 48 Stunden nicht bewegt wird.
- Nach 48 h sollte das Epoxidharz vollständig ausgehärtet sein. Die Platte für 3 h in den vorgeheizten Backofen bei 80 °C schieben, um sie endgültig auszuhärten.
- Entfernen Sie das ausgehärtete Epoxidharz von der Platte und der ursprünglichen PDMS-Form, indem Sie vorsichtig an der Kunststoffwand der Platte ziehen, bis sie bricht. Es sollte sich dann leicht vom Epoxidharz lösen und ablösen.
- Wischen Sie nach der Extraktion das restliche Fett von der neuen Epoxidreplik ab und setzen Sie sie kopfüber (d. h. mit den replizierten mikrofluidischen Elementen nach oben) in eine neue Kulturschale ein. Der Epoxid-Nachbau ist nun bereit für das PDMS-Casting.
- Verwenden Sie Druckluft oder N2, um PDMS- oder Schmutzreste von der Epoxidform zu blasen und spülen Sie sie 2x mit Isopropanol aus. Füllen Sie es ein drittes Mal und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf einer Orbitalschüttelplatte. Spülen Sie die Form noch einmal 3x mit Isopropanol aus und entsorgen Sie die restliche Flüssigkeit. Mit Luft oder N2 trocken föhnen oder in den 70 °C heißen Backofen stellen, bis er trocken ist.
Anmerkung: Befolgen Sie die Sicherheitsverfahren, wenn Sie mit Isopropanol arbeiten und es entsorgen.
- Halten Sie die Formplatten bis zum Gießen geschlossen. Folgen Sie den Schritten 1.1.8.-1.1.11.
- Stanzen und Formen des PDMS in einen MFC (Abbildung 2)
- Schneiden Sie die PDMS-Form von der Platte ab und entfernen Sie sie, indem Sie mit einem Skalpell den (+)-Markierungen auf den Wafern folgen. Wenden Sie keine Gewalt an, da die Formen zerbrechlich sind (Abbildung 2A).
- Befolgen Sie die Anweisungen auf der Skizze, um die Kammern je nach Versuchsaufbau zu stanzen und zu schneiden (Abbildung 2B-F).
- Für die Explantatkultur des Rückenmarks (Abbildung 2C, E) stanzen Sie zwei 7-mm-Vertiefungen in die distale Seite des großen MFC. Platzieren Sie die Vertiefungen so, dass sie sich mit den Kanalkanten überlappen. Stanzen Sie auf der proximalen Seite eine 7 mm Vertiefung in der Mitte des Kanals mit minimaler Überlappung, so dass genügend Platz für die Explantate bleibt. Stanzen Sie zwei zusätzliche 1 mm Löcher in die beiden Kanten des proximalen Kanals. Drehen Sie den MFC mit den mikrofluidischen Elementen nach oben und ritzen Sie mit einer 20 G Nadel drei kleine Explantathöhlen in die gestanzte 7 mm Vertiefung
.
- Für dissoziierte MN-Kultur (Abbildung 2D, F) stanzen Sie vier 6-mm-Wells in die Ränder der beiden Kanäle eines kleinen MFC.
- Sterilisieren des MFC für die Verwendung in Gewebekulturen
- Breiten Sie 50 cm lange Klebebandbänder auf der Bank aus. Drücken Sie die Kammer und ziehen Sie sie zurück, um das Klebeband zu zeigen (sowohl die obere als auch die untere Fläche) und entfernen Sie groben Schmutz. Legen Sie die sauberen Kammern in eine neue 15 cm lange Platte.
Anmerkung: Drücken Sie nicht direkt auf die mikrofluidischen Elemente, wenn diese nach oben zeigen.
- Inkubieren Sie die Kammern 10 Minuten lang in 70%igem Ethanol in analytischer Qualität auf einem Orbitalschüttler.
- Entsorgen Sie das Ethanol und trocknen Sie die Kammern in einer Gewebekulturhaube oder in einem Ofen bei 70 °C.
- Platzieren des MFC auf einer Glasbodenschale
- Platzieren Sie die Kammer in der Mitte einer 35 mm/50 mm Glasbodenschale in Gewebekulturqualität und üben Sie geringfügige Kraft auf die Ränder aus, damit sich das PDMS und der Schalenboden verbinden. Um ein Zerbrechen des Glasbodens zu vermeiden, üben Sie immer Kraft auf eine feste Oberfläche aus.
- 10 min bei 70 °C inkubieren. Die Kammern andrücken, um die Haftung auf der Platte zu verstärken.
- 10 min unter UV-Licht inkubieren.
- Beschichtung und Kultivierung
- Geben Sie 1,5 ng/ml Poly-L-Ornithin (PLO) in beide Kompartimente. Stellen Sie sicher, dass das PLO durch die Kanäle läuft, indem Sie das Beschichtungsmedium einige Male direkt in den Kanaleingang pipettieren.
- Untersuchen Sie die mikrofluidische Kammer unter einem Lichtmikroskop mit 10-facher Vergrößerung, um das Vorhandensein von Luftblasen zu überprüfen. Wenn Luftblasen die Mikrorillen verstopfen, stellen Sie den MFC für 2 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator. Entfernen Sie später die überschüssige Luft, die sich in den Kanälen festgesetzt hat, indem Sie die Beschichtungsmedien durch diese pipettieren. Über Nacht inkubieren.
- Ersetzen Sie PLO durch Laminin (3 μg/ml in DDW) für die Inkubation über Nacht auf die gleiche Weise.
- Waschen Sie das Laminin vor dem Plattieren mit einem neuronalen Nährmedium.
>2. Beschichtung neuronaler Kulturen
- Explantatkultur des Rückenmarks
- Mit einer geraden Schere und einer feinen Pinzette wird ein Rückenmark aus einem E12.5 ICR-HB9:GFP-Mausembryo präpariert. In einer 1X HBSS-Lösung mit 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) arbeiten (Abbildung 3A-C).
- Entfernen Sie mit einer Mikrodissektionsschere die Hirnhäute und die Hinterhörner (Abbildung 3D).
- Schneiden Sie das Rückenmark in 1 mm dicke Querschnitte (Abbildung 3E). Entsorgen Sie das gesamte Medium aus dem proximalen Kompartiment des MFC.
- Nehmen Sie mit einer Pipette ein einzelnes Rückenmarksexplantat mit einem Gesamtvolumen von 4 μl auf. Injizieren Sie das Explantat so nah wie möglich an der Höhle und ziehen Sie überschüssige Flüssigkeit über die seitlichen Ausgänge (1 mm Stanzen) aus der proximalen Vertiefung heraus. Die Explantate sollten in den proximalen Kanal gesaugt werden.
- Geben Sie langsam 150 μl Explantatmedium für das Rückenmark (SCEX, siehe Materialtabelle und Tabelle 3) in die proximale Vertiefung.
- Pflege der Explantatkultur des Rückenmarks
- Geben Sie SCEX-Medium in das proximale Kompartiment und reichhaltiges SCEX-Medium (SCEX mit 50 ng/ml BDNF und GDNF) in das distale Kompartiment. Halten Sie einen Volumengradienten von mindestens 15 μl pro Vertiefung zwischen den distalen Vertiefungen (höheres Volumen) und der proximalen Vertiefung ein.
- Frischen Sie das Medium alle 2 Tage auf. Es kann bis zu 3-5 Tage dauern, bis sich die Axone distal kreuzen.
>3. Axonaler Transport (Abbildung 4A)
- Markierung von Mitochondrien und sauren Kompartimenten
- Bereiten Sie frisches SCEX-Medium (oder CNB für dissoziiertes MN) vor, das 100 nM Mitotracker Deep Red FM und 100 nM LysoTracker Red enthält. 30-60 min bei 37 °C inkubieren. Andere Farben können verwendet werden, solange sich ihre Fluorophore nicht überlappen.
- 3x mit warmem CNB/SCEX Medium waschen. Die Platten sind bereit für die Bildgebung.
- Live-Bildgebung
- Erfassen Sie 100 Zeitraffer-Bildserien des axonalen Transports in 3-s-Intervallen, mit insgesamt 5 Minuten pro Film.
Anmerkung: Das in dieser Studie verwendete Bildgebungssystem umfasste ein inverses Mikroskop mit konfokaler Spinning-Disc, gesteuert über eine proprietäre Zellbildgebungssoftware, eine 60-fache Öllinse, NA = 1,4, und eine EMCCD-Kamera. Die Filme wurden in einer kontrollierten Umgebung bei 37 °C und 5 % CO2,
aufgenommen
Anmerkung: Je nach Experiment können längere oder kürzere Zeitrafferfilme aufgenommen werden. Sogar Filme über Nacht können bei Bedarf aufgenommen werden. Es ist jedoch wichtig, die Belichtungszeit und die Laserleistung sowie die Anzahl der Gesamtbilder zu reduzieren, um die Phototoxizität und das Ausbleichen während der Filmaufnahme zu verringern.
