Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung der Materialien
- Sterilisieren Sie alle Instrumente und ddH2O mit einem Autoklaven, bevor Sie den Versuch durchführen. Zu den Instrumenten gehören unter anderem chirurgische Scheren, Augenscheren, Pinzetten, Löffel, Zellkernteiler, Glasschalen (60–100 mm Durchmesser) und Glasbecher.
- Bereiten Sie die Krebslösung vor (Tabelle 1): Lösen Sie vor Gebrauch alle Chemikalien mit ddH2O auf. CaCI2 separat auflösen und unter Rühren langsam in die gemischte Lösung geben, um Ablagerungen zu vermeiden.
- Bereiten Sie das Spülmedium vor, das aus F12-Medien mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Antibiotikum/Antimykotikum (100x) besteht. Fügen Sie 5 ml FBS und 0,5 ml Antibiotikum/Antimykotikum zu 44,5 ml F12-Medien hinzu.
- Bereiten Sie das Neuron-Medium A vor, das aus neurobasalen A-Medien mit 2 % B-27, 1 % FBS, 1 % L-Glutamin, 1 % Antibiotikum/Antimykotikum (100x) und 0,1 % gliaabgeleitetem neurotrophem Faktor (GDNF) besteht. Fügen Sie 200 μl B-27, 100 μl FBS, 100 μl L-Glutamin, 100 μl Antibiotikum/Antimykotikum (100x) und 10 μl GDNF (10 μg/ml) zu 9,5 ml neurobasalem A media hinzu.
Anmerkung: Bereiten Sie Neuron Media A innerhalb einer Woche nach der Anwendung vor, um die Frische von B-27, L-Glutamin und GDNF zu gewährleisten.
- Bereiten Sie Neuron Media B mit dem gleichen Verfahren wie die Präparation von Neuron Media A vor, jedoch ohne Zugabe von FBS.
- Bereiten Sie Aufschlusslösung 1 vor, indem Sie 20 mg Kollagenase Typ II, 6 mg Rinderserumalbumin und 200 μl Antibiotikum/Antimykotikum (100x) in 10 ml sauerstoffstabiler Krebslösung auflösen.
- Bereiten Sie Aufschlusslösung 2 vor, indem Sie 1 ml 0,25 % Trypsin mit 4 ml der ausgewogenen Salzlösung von Hank verdünnen.
- Bereiten Sie eine Platte mit beschichteten Deckgläsern vor.
- Verwenden Sie eine Pinzette in einer Laminar-Flow-Bank, wenn Sie Glasdeckgläser in eine 48-Well-Kulturplatte einsetzen.
- Poly-D-Lysin mit ddH2O auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml als Poly-D-Lysin-Stamm verdünnen. Lagern Sie die Brühe bei –20 °C und tauen Sie sie auf, bevor
- Geben Sie 40 μl Poly-D-Lysin-Stamm auf jedes Deckglas und inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 10 min.
Anmerkung: Stellen Sie die Konzentration auf 4 μg/cm2 für verschiedene Platten mit unterschiedlichen Basalbereichen ein. Wenn beispielsweise die Basalfläche einer Vertiefung von einer 24-Well-Platte 2 cm2 beträgt, sollten wir 80 μl Poly-D-Lysin-Stamm in eine Vertiefung übertragen. Jeder cm2 würde 4 μg Poly-D-Lysin enthalten.
- Entfernen Sie das Poly-D-Lysin in der 48-Well-Platte und spülen Sie die Deckgläser dreimal mit ddH2O aus.
- Trocknen Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang in einer Laminar-Flow-Haube, um sicherzustellen, dass die Platte wasserfrei ist.
- Lagern Sie die Platte vor der Lamininbeschichtung bei 4 °C für höchstens 1 Tag. Für die Langzeitlagerung ist die Lagerung der Platte bei -20 °C vorzuziehen.
- Laminin bei 4 °C auftauen. Laminin mit ddH2O auf eine Konzentration von 50 μg/ml als Lamininmaterial verdünnen. Lagern Sie den Fond bei –20 °C und tauen Sie ihn vor Gebrauch bei 4 °C auf.
- Mit einer Pipette 100 μl verdünntes Laminin auf die Oberseite jedes Deckglases übertragen und Laminin bei 4 °C für 1 h.
inkubieren
Anmerkung: Stellen Sie die Konzentration auf 5 μg/cm2 für verschiedene Platten mit unterschiedlichen Basalbereichen ein. Wenn beispielsweise die Basalfläche einer Vertiefung einer 24-Well-Platte 2 cm2 beträgt, dann übertragen Sie 200 μl verdünntes Laminin in eine Vertiefung. Jeder cm2 würde 5 μg Laminin enthalten.
- Entfernen Sie die Lamininlösung und spülen Sie die Deckgläser einmal mit ddH2O aus. Führen Sie diesen Vorgang an der Kante des Deckglases durch, um Kratzer zu vermeiden.
Anmerkung: Beschichtete Deckgläser können bei maximal 2 °C bei 4 °C gelagert werden.
>2. Blasenernte
- Besorge dir fünf Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten.
- Carbogen (95 % Sauerstoff, 5 % CO2) mindestens 30 min in einem Eisbad in die Krebslösung ziehen, um einen stabilen Sauerstoffstatus und pH-Wert zu erreichen.
- Nach der Euthanasie durch Zervixluxation weichen Sie die Ratten 30 s lang in 75%igem Ethanol zur Sterilisation ein.
- Legen Sie Ratten auf ein sterilisiertes chirurgisches Handtuch und entblößen Sie ihren Bauch. Öffnen Sie die Bauchhöhle und legen Sie die Blase mit einer Schere und einer Pinzette zum Vorschein.
- Heben Sie die Blase vorsichtig an und schneiden Sie die Blase mit einer weiteren Schere und Pinzette vom Blasenhals ab, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Legen Sie die Blase schnell in eine kalte, sauerstoffstabile Krebslösung, um das Überleben der Zellen zu verbessern.
Anmerkung: Sobald die Blase entfernt ist, führen Sie die folgenden Vorgänge schnell durch, um die Aussichten auf ein Überleben der Neuronen zu verbessern.
- Die Krebslösung in drei Glasschalen und Glasbecher geben.
- Glasschalen und Becher mit Krebslösung in einem Eisbad zum Vorkühlen vorbereiten.
- Kennzeichnen Sie diese Behälter entsprechend mit den Nummern 1–3, um Verwechslungen zu vermeiden.
- Kombinieren Sie jede Glasschale mit einer Pinzette und einem Löffel-Kernteiler.
- In der Glasschale 1 die Blase mit einer Augenschere aufschneiden und mit einer Pinzette und einem Löffel Zellkernteiler aufklappen.
- Spülen Sie die Blase im Becherglas 1 aus und legen Sie sie in die Glasschale 2.
- Entfernen Sie anhaftendes Fett auf der Gewebeoberfläche mit einer Pinzette und einer Augenschere in einer Glasschale 2.
- Spülen Sie die Blase im Becherglas 2 aus und legen Sie sie in die Glasschale 3.
- Kratzen Sie die Blase vorsichtig mit der Pinzette und dem Zellkernteiler des Löffels auf die Glasschale 3, um exogene Ansätze zu entfernen.
- Spülen Sie die Blase im Becherglas 3, geben Sie die Blase in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 14 mL kalter Krebs-Lösung und schleudern Sie die Probe 1 Minute lang bei 356 x g und 4 °C.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt zweimal in zwei weiteren Röhrchen mit Krebslösung, um die Kontamination zu reduzieren.
>3. Zweistufige Blasenverdauung
- Die Blase wird aus dem Zentrifugenröhrchen in ein 2-ml-Fläschchen mit 1 ml Aufschlusslösung 1 überführt. Schneiden Sie die Blase mit einer Augenschere in Lösung in kleine Stücke (kleiner als 1 mm).
- Mischen Sie die Blasenlösung mit 9 mL Aufschlusslösung 1 in einer sterilen Zellkulturschale (100 mm Durchmesser). Der Aufschluss der Stufe 1 in einem Schüttelinkubator wird 1 Stunde lang bei 5 % CO2, 37 °C und 200 U/min durchgeführt.
- Nach Schritt 1 Aufschluss zentrifugieren Sie die Lösung bei 356 x g bei 4 °C für 8 min.
- Aufschlusslösung 2 zum Vorwärmen in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen.
- Nach der Zentrifugation ist der Überstand, der die Aufschlusslösung 1 enthält, zu entfernen und das Zellsediment zu entnehmen. Etwas restliche Flüssigkeit ist erlaubt. Die vollständige Entfernung der Lösung kann den Zellverlust fördern.
- Mischen Sie das Zellsediment mit der warmen Aufschlusslösung 2 in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen und schütteln Sie die Mischung während des Aufschlusses in einem 37 °C warmen Wasserbad für 5 Minuten. Überschreiten Sie nicht 7 Minuten der Verdauung in Schritt 2, da sonst die Neuronen zugrunde gehen.
- Nach dem Aufschluss ist das Trypsin in der Mischung sofort mit 10 ml kaltem Spülmedium zu deaktivieren.
Anmerkung: Führen Sie die folgenden Schritte bei 0 °C bis 4 °C aus. Ein Eisbad könnte solche Bedingungen schaffen.
- Ernten Sie das Zellsediment nach der Zentrifugation bei 356 x g bei 4 °C für 8 min. Entfernen Sie so viel Medium wie möglich, da das verbleibende Trypsin das Zellwachstum beeinträchtigt.
- Resuspendieren Sie das Sediment vorsichtig mit 3 ml Neuronenmedium. Stellen Sie sicher, dass in der zellhaltigen Lösung keine Luftblasen entstehen, um eine hohe Überlebensrate zu erzielen.
- Filtrieren Sie das Mischmedium durch ein 70-μm-Zellsieb in ein 50-mL-Zentrifugenröhrchen.
- Halten Sie das Filtrat auf einem Shaker bei 30 U/min in einem Eisbad für 30 Minuten. Dieser Schritt ist nicht notwendig, wird aber empfohlen.
- Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 356 x g bei 4 °C für 8 Minuten und resuspendieren Sie die Zellpellets vorsichtig in 1 mL Neuronenmedium A.
- Geben Sie 500 μl Zellmischung in jede Vertiefung der vorbereiteten 48-Well-Platte.
- Kultivieren Sie Zellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
- Ersetzen Sie alle Medien innerhalb von 1 h durch Neuron Media B, um eine serumfreie Kultur zu erhalten.
- Wechseln Sie alle 3 Tage die Hälfte des Neurons media B.
Anmerkung: Die Neuronen sind nach 5–7 Tagen Kultur bereit für immunzytochemische Experimente.
Tabelle 1. Zusammensetzung der Krebslösung
kg
kg
kg
| Zutaten | Molarität (mM) |
| NaCI | Nr. 120 |
| Kci | 5,9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2,6H 2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2,5 |
| Traubenzucker | 11,5 |
